Engineering hexuronic acid catabolism

Abstract

Metabolic engineering is an emerging field targeted to the improvement of pathways for the production of high-value compounds. Citrus peel is produced at an estimated 15,000,000 t per year worldwide and its disposal causes environmental problems. The main constituent of citrus peel is D-galacturonic acid. The aim of this project is to convert D-galacturonic acid to useful chemicals using genetically engineered moulds. Aspergillus niger was chosen since it is naturally a good consumer of D-galacturonic acid and produces the enzymes required for citrus peel hydrolysis. In the present study, engineered Aspergillus niger strains were used where (i) the gaaB coding for L-galactonate dehydrogenase was deleted (ΔgaaB) and (ii) the gaaB was deleted and the gaaA coding for D-galacturonate reductase was overexpressed (ΔgaaB-gaaA). These strains were used for solid-state and submerged state fermentation to convert orange peel to L-galactonate in a consolidate process. The strains were able to convert up to 87 % of Dgalacturonic acid to L-galactonate by solid-state fermentation. Another pathway that was studied was the eukaryotic D-Glucuronic acid pathway. In this pathway is a ddecarboxylase that converts 3-keto-L-gulonate to L-xylulose. The reaction is poorly characterized and the gene not known. It was tried to assay this activity in a coupled enzyme assay. In this assay Lgulonic acid is the initial substrate, an NAD-dependent L-gulonate-3-dehydrogenase (GDH) that produces the substrate for the decarboxylase. Lxylulose reductase is then detected by an NADPH-dependent L-xylulose reductase from Aspergillus niger (lxrA). To follow the reaction NADPH was monitored at 340 nm. To avoid the interference of NADH that also absorbs at 340 nm Thio-NAD+ was used for the dehydrogenase. Active GDH and lxrA were prepared and the assay tested with ammonium sulfate precipitates from bovine liver extract. A 3-keto-L-gulonate decarboxylase activity could not be detected.

A engenharia metabólica é uma área emergente que visa o aperfeiçoamento de vias metabólicas para produção de compostos valiosos. A produção mundial de casca de frutos cítricos é estimada em 15,000,000 de toneladas por ano, e o seu descarte causa problemas ambientais. O principal constituinte da casca de frutos cítricos é o ácido D-galacturónico. O objetivo deste projeto é converter o ácido D-galacturónico noutros químicos proveitosos, utilizando para tal bolores geneticamente modificados. Aspergillus niger foi escolhido por ser naturalmente um bom consumidor do ácido Dgalacturónico e produtor das enzimas necessárias à hidrólise de casca de frutos cítricos. No presente trabalho, estirpes de Aspergillus niger foram geneticamente modificados onde (i) o gene gaaB que codifica para a L-galactonato desidratase foi deletado (ΔgaaB) e (ii) o gene gaaB foi deletado e o gene gaaA que codifica para a D-galacturonato reductase se encontrava sobreexpresso (ΔgaaB-gaaA). Estas estirpes foram utilizadas para fermentação submersa e em estado sólido para converter casca de laranja em L-galactonato num processo consolidado. As estirpes foram capazes de converter, até 87 %, de ácido D-galacturónico em L-galactonato por fermentação em estado sólido. Outra via metabólica estudada foi a via eucariota do ácido glucurónico. Nesta via metabólica é uma descarboxilase que converte o 3-ceto-L-gulonato em Lxilulose. A reação ainda não está claramente caracterizada e o gene não é conhecido. Um teste enzimático acoplado foi realizado de forma a testar a sua atividade. Neste ensaio o ácido L-gulónico é o substrato inicial, uma Lgulonato- 3-desidrogenase NAD-dependente (GDH) que produz o substrato para a descarboxilase. A L-xilulose reductase é então detetada por uma Lxilulose reductase NADPH-dependente de Aspergillus niger (lxrA). Para seguir a reação, o NADPH foi monitorizado a 340 nm. Para evitar a interferência do NADH que também absorve a 340 nm, Tio-NAD+ foi usado para a desidrogenase. GDH e lxrA ativas foram preparadas e o ensaio testado com precipitados sulfato de amónio de extrato de fígado bovino. A atividade da 3-ceto-Lgulonato descarboxilase não foi detetada.