Análise do perfil proteico de biofluidos em pacientes com hemofilia A

Abstract

A hemofilia A é um distúrbio hemorrágico congénito caracterizado pelo comprometimento da cascata de coagulação devido à ausência ou deficiência da atividade do fator VIII que é provocada por uma mutação presente no respetivo gene. As características clínicas e as complicações que acompanham os pacientes hemofílicos ao longo da sua vida, como hemorragias espontâneas ou artropatia resultante de hemartroses recorrentes, exigem o recurso frequente a serviços de saúde. Contudo, nem sempre se verifica uma correlação entre a severidade da doença, que é inferida a partir do genótipo, e o fenótipo apresentado clinicamente. Considerando que a distinção entre fenótipos tem implicações para a prática clínica, torna-se fundamental o seu estudo do ponto de vista bioquímico. O presente trabalho teve como objetivo a análise do perfil proteico de soro e plasma de pacientes com hemofilia A severa, acompanhados no Serviço de Imunohemoterapia do Hospital Infante D. Pedro, em Aveiro, para melhor compreender as alterações proteicas no soro/plasma induzidas pela mutação que provoca esta doença. Neste sentido, procedeu-se à análise do perfil de proteínas do soro/plasma por SDS-PAGE e da atividade de proteases, presentes nestes biofluidos, por zimografia em gel. Complementarmente, realizou-se uma análise por imunoblotting de forma a verificar se as alterações na atividade da MMP-9, detetada na análise por zimografia, se deviam a diferenças no teor desta protease. Por último, com vista a integrar a MMP-9 nos processos celulares, recorreu-se à ferramenta bioinformática String para analisar as interações proteína-proteína com a MMP-9. Os resultados obtidos mostraram que a hemofilia A promove alterações da atividade proteolítica do soro e do plasma, caracterizadas pela diminuição significativa da atividade de MMP-9, apesar de presente em maior quantidade, o que sugere o envolvimento do inibidor TIMP-1 na regulação da sua atividade. Por sua vez, a análise efetuada por String evidenciou a interação desta metaloproteinase com vários fatores da via intrínseca da cascata de coagulação, confirmando, desta forma, o potencial envolvimento da MMP-9 na hemofilia A.

Hemophilia A is a congenital blood disorder, characterised by the impairment of the coagulation cascade due to the absence or deficiency of factor VIII activity, which is caused by a mutation in the factor’s gene. The clinical features and the complications that accompany hemophiliacs throughout their lives, such as spontaneous bleeds and arthropathy that results from recurrent hemarthrosis, require the frequent use of health services. However, the correlation between the disease’s severity, which is inferred from the genotype, and the phenotype presented clinically is not always found. Considering that the distinction between phenotypes has implications to clinical practice, its study becomes essential from the biochemical point of view. The present study aimed to analyse the protein profile of serum and plasma from severe hemophilia A patients, who have been accompanied at the Imunohemotherapy Service of Infante D. Pedro Hospital, in Aveiro. This analysis was designed to better understand the protein alterations in serum/plasma induced by the mutation that causes this disease. In this sense, we determined protein profile of serum/plasma by SDS-PAGE and protease activity by in gel zymography. Then, an immunoblotting analysis was performed in order to verify if the alterations in MMP-9 activity, which had been detected by in gel zymography, were due to differences in the quantity of this protease. Finally, we used the bioinformatical tool String to study the protein-protein interactions with MMP-9 with the purpose of integrating this protease in cellular activities. The results showed that hemophilia A promotes alterations of serum and plasma proteolytic activity, characterised by the significant decreased activity of MMP-9, despite being present in higher levels, which suggests the influence of inhibitor TIMP-1 in the regulation of its activity. Furthermore, the analysis carried with String highlighted the interaction of MMP-9 with several factors of the intrinsic pathway of the coagulation cascade, confirming the potential involvement of this protease in hemophilia A.