Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/11617
Title: Regulation of single exocytotic events by the cAMP signaling pathway
Other Titles: Regulação de eventos exocitóticos pela via de sinalização do cAMP
Author: Calejo, Ana Isabel Costa
Advisor: Gonçalves, Maria Paula Polónia
Zorec, Robert
Keywords: Biologia
Citotoxicidade - Alumínio
Exocitose
Defense Date: 31-Jul-2013
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Permanece por esclarecer como a via de sinalização do cAMP modula a exocitose regulada. Os principais objetivos deste trabalho foram: i) avaliar o efeito do cAMP nos eventos exocitóticos, nas propriedades dos poros de fusão e na secreção hormonal; ii) perceber o impacto da sinalização por cAMP-HCN na exocitose e nas propriedades do poro de fusão; e iii) estudar as propriedades do poro de fusão na presença de um agente neurotóxico comum, como o alumínio. Lactotrofos, isolados a partir da hipófise anterior de ratos Wistar machos, foram usados como modelo celular. Os eventos unitários de fusão exocitótica e a prolactina (PRL) libertada foram avaliados, respetivamente, em ensaios eletrofisiológicos efectuados segundo a técnica de contacto hermético no modo sobre a célula aderida à pipeta porta-elétrodo e com recurso a métodos imunológicos de deteção. Os níveis intracelulares de cAMP foram aumentados por 3-isobutil-1-metilxantina (IMBX), forscolina e N6,2'-O-dibutiril adenosina- 3',5'-monofosfato cíclico (dbcAMP). A expressão dos canais HCN foi determinada por Western-blot, qRT-PCR e imunocitoquímica em combinação com microscopia confocal. Culturas primárias de lactotrofos foram também transfetadas com DNA plasmídico que codifica HCN2 juntamente com a proteína-verde-fluorescente e um agente farmacológico foi usado para avaliar o efeito de cAMP-HCN na exocitose. Observou-se que os lactotrofos responderam à forscolina e ao dbcAMP libertando PRL de um modo bifásico e dependente da concentração, uma vez que a secreção aumentou e diminuiu, respectivamente, na gama de baixas e altas concentrações. Os compostos que elevaram os níveis de cAMP aumentaram os eventos transientes e impediram a fusão completa. Além disso, o dbcAMP promoveu o aparecimento de eventos exocitóticos transientes de elevada periodicidade, cujos poros de fusão, de maior diâmetro, se mativeram abertos durante mais tempo. A expressão das quatro isoformas de HCN foi confirmada nos lactotrofos ao nível do mRNA e, tal como no coração, rim e hipófise, o mais abundante codifica a isoforma HCN2. Nos lactotrofos com sobre-expressão desta isoforma, o dbcAMP não só aumentou a frequência dos eventos transientes e a condutância dos poros, mas também a frequência dos eventos de fusão completa. Enquanto o bloqueador dos canais HCN, ZD7288, reduziu a frequência dos eventos transientes e de fusão completa desencadeados por dbcAMP e diminuiu o diâmetro dos poros de fusão. A simultânea diminuição da libertação de PRL, da frequência dos eventos transientes e do diâmetro dos poros de fusão representaram as principais alterações observados após pré-tratamento dos lactotrofos com concentração micromolar de alumínio. Em conclusão, os resultados demonstram que elevados níveis de cAMP reduzem a secreção de PRL devido à estabilização dos poros de fusão no estado de maior abertura. Além disso, a via de sinalização cAMP-HCN afecta a actividade exocitótica e modifica as propriedades dos poros de fusão, que parecem ser igualmente importantes na citotoxicidade induzida por alumínio.
How the second messenger cAMP modulates regulated exocytosis is still poorly understood. The goals of this work were: i) to evaluate cAMP effect on single exocytotic events, fusion pore properties and hormone release; ii) to assess the impact of cAMP-HCN signaling on exocytosis and fusion pore properties; and iii) to study fusion pore properties in the presence of a common neurotoxic agent, such as aluminium. Anterior pituitary lactotrophs isolated from male Wistar rats were used as the cell model. Electrophysiology in cell attached patch-clamp mode and immuno assays were used to monitor unitary exocytic fusion events and prolactin (PRL) release, respectively. Intracellular cAMP concentration was raised with 3- isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), forskolin and N6,2’-O-dibutyryl adenosine- 3′,5′-cyclic monophosphate (dbcAMP). HCN channel expression was determined by using Western-blot, qRT-PCR and immunocytochemistry in combination with confocal microscopy. Primary cell cultures were also transfected with plasmid DNA encoding HCN2 together with enhanced-greenfluorescence protein and a pharmacological agent was applied to evaluate cAMP-HCN effects on exocytosis. We observed that lactotrophs responded to forskolin and dbcAMP by releasing PRL in a biphasic dose-dependent manner, since secretion increased and decreased in the presence of low and high concentration ranges, respectively. cAMP-increasing agents enhanced transient events, while full-fusion events were prevented. Moreover, dbcAMP promoted the appearance of extreme periodic bursts of transient events that exhibited longer fusion pore life-time and wider diameters. The expression of the four HCN isoforms was confirmed at mRNA transcript level in lactotrophs and, like in heart, kidney and pituitary, the most abundant encodes HCN2 isoform. In HCN2 over-expressing lactotrophs, dbcAMP not only enhanced the frequency of transient events and pore conductance but also the frequency of full-fusion events. While, the HCN channel blocker, ZD7288, reduced the frequency of full-fusion and transient events elicited by dbcAMP and narrowed the fusion pore diameters. Finally, the simultaneous reduction on PRL release, transient events frequency and fusion pore diameters represented the main alterations observed after lactotrophs pretreatment with micromolar aluminium concentration. In conclusion, the results show that high cAMP reduces PRL secretion due to the stabilization of the wide fusion pore state. Additionally, cAMP-HCN signaling cascade affects exocytic activity and modifies fusion pore properties, which also appear to be relevant in the aluminium induced cytotoxicity.
Description: Doutoramento em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/11617
Appears in Collections:DBio - Teses de doutoramento
UA - Teses de doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
7867.pdf3.7 MBAdobe PDFView/Open


FacebookTwitterLinkedIn
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.