Epi-drugs regulate H2A.Z via SIRT1 upregulation in prostate cancer

Abstract

As actuais abordagens terapêuticas para cancro de próstata (PCa) avançado são limitadas e ineficazes. Uma vez que as aberrações epigenéticas são muito comuns em PCa, o uso terapêutico de fármacos epigenéticos pode ser uma alternativa viável. A variante de histona H2A.Z e sua forma acetilada têm sido associadas com a activação de oncogenes em células de PCa, devido à sua localização perto do TSS. Assim, objetivou-se avaliar o efeito de fármacos epigenéticos na regulação da expressão da variante H2A.Z. Três linhas celulares de PCa (LNCaP, DU145 e PC-3) foram tratadas com 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC) e tricostatina A (TSA). Os níveis de transcripto e proteína dos genes H2AFZ e SIRT1 foram avaliados por qRT-PCR e Western Blot, respectivamente. ChIP foi realizado para avaliar em que medida o tratamento alterava o padrão de marcas de histonas. Subsequentemente, a exposição a nicotinamida e resveratrol, um inibidor e um indutor de actividade sirtuina 1, respectivamente, foi realizada para avaliar o papel da sirtuina 1 nos níveis H2A.Z. Além disso, um ensaio de ligação proximal (PLA) foi realizado para avaliar a capacidade dos farmacos epigenéticos em regular a interacção entre a sirtuina 1 e a H2A.Z. O tratamento com TSA, sozinho ou combinado com DAC, levou a um aumento dos níveis de transcripto do gene H2AFZ, embora com uma simultânea diminuição dos níveis de proteína. Por outro lado, os níveis de transcripto e de proteína do gene SIRT1 aumentaram após a exposição aos fármacos. O ChIP revelou um aumento de marcas de activação da transcrição na região do TSS para ambos os genes. Surpreendentemente, após a inibição da sirtuina 1, níveis H2A.Z aumentaram abruptamente, enquanto que a indução da sirtuina 1 levou a uma queda abrupta nos níveis de H2A.Z. Finalmente, os resultados de PLA mostraram que os fármacos epigenéticos favorecem a interacção entre as duas proteínas estudadas. Embora os fármacos epigenéticos sejam capazes de regular a transcrição de ambos os genes, a falta de correlação entre os níveis de mRNA e proteína para H2A.Z sugerem o envolvimento de um mecanismo pós-translacional. De facto, a sirtuina 1 tem a capacidade de degradar H2A.Z, tal como previamente descrito para cardiomiócitos. Desta forma, os níveis de proteína H2A.Z são indirectamente regulados por fármacos epigenéticos, provavelmente através da sobreregulação do gene SIRT1. Em tumores primários da próstata, a sobreexpressão de H2AFZ e subexpressão de I validam os dois genes como alvos de tratamento epigenético.

Current therapeutic approaches for advanced prostate cancer (PCa) are limited and mostly ineffective. Because epigenetic aberrations are common in PCa, the therapeutic use of epigenetic modulating drugs might provide a therapeutic alternative. The histone variant H2A.Z and its acetylated form have been previously associated with activation of oncogenes owing to their location near the TSS in PCa cells. Thus, we aimed to evaluate the effect of epigenetic modulating drugs on H2A.Z expression. Three PCa cell lines (LNCaP, DU145 and PC-3) were treated with 5-aza-2’-deoxycytidine (DAC) and trichostatin A (TSA). Transcript and protein levels of H2AFZ and SIRT1 were assessed by quantitative RT-PCR and Western blot, respectively. ChIP was performed to evaluate how treatment altered the pattern of histone marks. Subsequently, exposure to nicotinamide and resveratrol, an inhibitor and an inducer of sirtuin 1 activity, respectively, was performed to evaluate the role of sirtuin 1 in H2A.Z levels. In addition, PLA was performed to assess whether epigenetic drugs regulate sirtuin 1 and H2A.Z interaction. Treatment with TSA alone and combined with DAC led to an increase of H2AFZ transcript levels, although with a concomitant decrease in protein levels. Conversely, SIRT1 transcript and protein levels increased after drug exposure. ChIP revealed an increase of activation marks within the TSS region for both genes. Remarkably, after inhibition of sirtuin 1, H2A.Z levels increased dramatically, whereas induction of sirtuin 1 led to an abrupt decrease in H2A.Z levels. Finally, PLA assay results showed that epigenetic modulating drugs favored the interaction between sirtuin 1 and H2A.Z. Although epigenetic drugs are able to regulate both H2AFZ and SIRT1 transcription levels, the lack of correlation between mRNA and protein levels for H2AZ suggest the involvement of a post-translational mechanism. Indeed, sirtuin 1 has the ability to degrade H2A.Z, as previously reported for cardiomyocytes. Thus, H2A.Z protein levels are indirectly regulated by epigenetic drugs, probably through SIRT1 upregulation. In primary PCa, overexpression of H2AFZ and downregulation of SIRT1 validate both genes as targets of epigenetic treatment.