Salivary proteomics and peptidomics of type 1 diabetes Mellitus

Abstract

A Diabetes Mellitus (DM) compreende um conjunto de desordens metabólicas comuns caracterizadas por hiperglicemia, que afeta diferentes órgãos do organismo. Ao longo do tempo, ocorrem danos microvasculares no glomérulo renal, retina e nervos periféricos, bem como doença macrovascular nas artérias. A composição da saliva também é afetada pela DM, com consequências na homeostasia oral. No entanto, o proteoma e o peptidoma salivar têm sido pouco explorados na DM tipo 1 e nas suas complicações crónicas. Tendo em conta o crescente interesse na saliva como fluido diagnóstico, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar os eventos proteolíticos subjacentes à DM tipo 1 e às suas complicações microvasculares, bem como, caracterizar as alterações induzidas pela DM tipo 1 no proteoma e peptidoma salivar. A DM tipo 1 e particularmente as complicações microvasculares associadas modulam o perfil proteolítico dos fluidos biológicos, com diferenças significativas de atividade observadas na urina e saliva, atribuídas principalmente ao complexo Metaloproteinase da Matriz (MMP)-9/lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos, aminopeptidase N, azurocidina e calicreína 1. O aumento da atividade proteolítica observado na saliva total dos diabéticos resultou no aumento da percentagem de péptidos, principalmente de um número acrescido de fragmentos de colagénio do tipo I, refletindo possivelmente um estado inflamatório crónico dos tecidos orais e periodontais. O peptidoma também corrobora uma maior suscetibilidade das proteínas salivares, especificamente, das proteínas ricas em prolina básicas (bPRP) 1, bPRP2 e proteínas ricas em prolina ácidas (aPRP) à proteólise, evidenciando a geração de fragmentos de proteínas associadas à ligação a bactérias. A análise do proteoma salivar baseada em iTRAQ mostrou uma sobre-expressão de L-plastina, fator do adenocarcinoma do pâncreas e das proteínas S100-A8 e S100-A9, enfatizando a importância do sistema imune inato na patogénese da DM tipo 1 e das complicações microvasculares associadas. A análise integrada de todas as proteínas expressas diferencialmente entre os pacientes diabéticos com ou sem complicações microvasculares e indivíduos saudáveis foi realizada com o STRING, onde se observam três conjuntos funcionalmente ligados, um compreende a interação entre o colagénio tipo I, colagénio tipo II e MMP-9, um segundo conjunto envolve a MMP-2 e o colagénio de tipo I e um terceiro conjunto composto por proteínas salivares e inflamatórias. Estes conjuntos estão associados com as vias Kegg de interação recetor-matriz extracelular, de adesão focal e migração transendotelial dos leucócitos. Por outro lado, a análise do proteoma e peptidoma salivar destacou potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico da DM tipo 1 e das suas complicações.

Diabetes Mellitus (DM) comprises a set of common metabolic disorders that share the phenotype of hyperglycemia, which affect many different organ systems in the body. Over time, DM-specific microvascular disease in renal glomerulus, retina and peripheral nerves occurs, as well as macrovascular pathology in arteries. The composition of saliva is also affected by DM with consequences in the oral homeostasis; however, the salivary proteome and even more the peptidome has been quite unexplored in type 1 DM and related chronic complications. Taking into account the growing interest in saliva as diagnosis fluid, the main goal of this thesis was to disclose the proteolytic events underlying type 1 DM and related microvascular complications as well as to characterize DM-induced alterations in salivary proteome and peptidome. Type 1 DM and particularly the associated microvascular complications modulates biofluids’ proteolytic profile, with significant activity differences noticed for urine and saliva mainly attributed to Matrix Metalloproteinase (MMP)-9/neutrophil gelatinase-associated lipocalin complex, aminopeptidase N, azurocidin and kallikrein 1. The higher proteolytic activity noticed in whole saliva of diabetics leads to an increase in the percentage of peptides, mainly consisting of an augmented number of collagen type I fragments, possibly reflecting a chronic inflammatory state of oral and periodontal tissues. Moreover, peptidome data also support a diabetes-related higher susceptibility of salivary proteins, namely basic proline-rich protein (bPRP) 1, bPRP2 and acidic proline-rich proteins (aPRP) to proteolysis evidencing the generation of protein fragments associated with bacterial attachment. iTRAQ-based salivary proteome profiling evidenced an overexpression of L-plastin, pancreatic adenocarcinoma factor, protein S100-A8 and S100-A9, emphasizing the importance of the innate immune system in the pathogenesis of type 1 diabetes mellitus and related microvascular complications. The integrative analysis of all different expressed proteins performed with STRING shows three clusters functionally connected, one comprehending collagen types I and II interaction and MMP-9, a second involving MMP-2 and collagen type I, and a third cluster compreending salivary proteins and inflammatory proteins. These clusters are associated with the Kegg pathways extracellular matrix-receptor interaction, focal adhesion, and leukocyte transendothelial migration. In addition, the salivary proteome and peptidome analysis highlighted potential biomarkers for the diagnosis and prognosis of type 1 diabetes mellitus and related complications.