Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/11003
Title: Aplicação de nanopartículas magnéticas para caracterização de proteases
Author: Silva, Rui Pedro Oliveira
Advisor: Vitorino, Rui Miguel Pinheiro
Silva, Ana Luísa Daniel da
Keywords: Biotecnologia molecular
Enzimas
Proteómica
Enzimas proteolíticas
Fluidos corporais
Inibidores de enzimas
Nanopartículas - Propriedades magnéticas
Defense Date: 7-Jan-2013
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: Durante vários anos, as proteases foram vistas como enzimas cuja função era, fundamentalmente, a degradação de proteínas em processos como a digestão, coagulação sanguínea entre outros. Contudo, com o aumento do conhecimento científico da estrutura e função destas enzimas, esta visão foi sendo progressivamente alterada e atualmente as proteases são reconhecidas pela sua importância na sinalização celular em diversos processos biológicos. A caracterização do modo de atuação destas enzimas é importante. Para tal, o desenvolvimento de abordagens experimentais que permitam o enriquecimento e caracterização de proteases será crucial. No presente trabalho, foram sintetizadas e caracterizadas nanopartículas magnéticas de óxido de ferro, acopladas com inibidores específicos para proteases existentes em diversos biofluidos. Estudou-se o efeito da funcionalização química da superfície das nanopartículas magnéticas na estrutura e morfologia das nanopartículas. Após o acoplamento com os inibidores, foi testada a capacidade de interação destas nanopartículas com as proteases presentes nos biofluidos. Os resultados evidenciaram que após a funcionalização e acoplamento com os inibidores em estudo, não ocorreu alteração da estrutura cristalina e da morfologia das nanopartículas, não se tendo ainda verificado fenómenos de aglomeração. Os resultados obtidos por SDS-PAGE permitiram constatar que as nanopartículas com grupos carboxilo com ação quelante à superfície (NPs@EDTA) apresentaram capacidade para enriquecer especificamente metaloproteases, uma família de proteases cujo centro catalítico possui catiões metálicos (Zn2+). Estes resultados foram ainda validados por zimografia tendo-se a ocorrência de ligações específicas entre as metaloproteases e os inibidores ligados às nanopartículas magnéticas. No caso dos resultados do SDS-PAGE das NPs@aprotinina foi possível observar especificidade das interações entre as NPs e proteínas-alvo da saliva, não se tendo observado a ligação de proteínas abundantes na saliva, como a amilase, às NPs. Em suma, no presente trabalho desenvolveu-se um sistema de enriquecimento de proteases de sistemas biológicos envolvendo nanopartículas magnéticas que se revelou eficaz.
Proteases have been seen as enzymes involved in protein degradation, in processes like digestion or blood coagulation. However, with the increase of the scientific knowledge and comprehension about their structures and functionality, this notion has evolved and now proteases are known to participate in a wide range of biological processes. Although, the importance of proteases on those processes is recognized, studies focused on their mechanism of action are very important. In this sense, strategies that allow proteases enrichment from biological samples followed by its characterization will be crucial. In the present work, iron oxide magnetic nanoparticles were synthetized and then coupled with specific inhibitors to proteases present in human biofluids. These nanoparticles were analyzed based on its morphology, stability in solution and other properties to evaluate the effects of the functionalization strategy. The ability of these magnetic nanoparticles coupled with inhibitors to interact with specific proteases from human biofluids was also evaluated. The results showed that after functionalization and coupling with inhibitors, the magnetic nanoparticles maintained their morphology, dispersibility in solution and the crystalline structure. SDS-PAGE data evidenced that nanoparticles surface functionalized with chelating carboxyl groups (NPs@EDTA) allows the specific enrichment of metaloproteases, a family of proteases whose active-site has metallic ions. These results were further validated by zymography in which a substrate for metalloproteases (gelatin) was incorporated. In the zymography gel, the presence of metaloproteases was confirmed, which corroborates the specificity of the interaction between metalloproteases from biological samples and the nanoparticles coupled with inhibitors. Regarding SDS-PAGE data of NPs@aprotinine it was observed the existence of specific interactions between NPs and salivary target proteins, not being observed the binding of abundant salivary proteins, such as amylase, to the NPs. In conclusion, functionalized magnetic nanoparticles coupled with proteases inhibitors showed high potential to be applied as specific capture systems for the characterization of proteases from biological samples.
Description: Mestrado em Biotecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/11003
Appears in Collections:UA - Dissertações de mestrado
DQ - Dissertações de mestrado

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
7125.pdf3.07 MBAdobe PDFView/Open


FacebookTwitterLinkedIn
Formato BibTex MendeleyEndnote Degois 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.