Matrizes de quitosano/grânulos bifásicos para libertação de fármacos

Abstract

Um dos grandes desafios no campo da engenharia de tecidos (ET) é o desenvolvimento de estruturas porosas tridimensionais (scaffolds) que permitam a adesão e a proliferação celular bem como a produção de matriz extracelular à taxa a que decorre a degradação do scaffold. Para algumas aplicações biomédicas, o comportamento de degradação da hidroxiapatite sintética pode ser muito lento tornando-se necessários fosfatos de cálcio (CaP) com uma taxa de reabsorção mais rápida com o objetivo de acelerar o processo de substituição óssea. Por esta razão, compostos de β-fosfato tricálcico (β-TCP) e hidroxiapatite (HAp), os chamados fosfatos de cálcio bifásicos (BCP), que combinam a excelente bioatividade da HAp com a boa reabsorção do β-TCP são candidatos interessantes para a substituição óssea e para sistemas de libertação controlada de fármacos. No presente trabalho produziram-se, por atomização, três tipos de grânulos de CaP, isto é, HAp e bifásicos (β-TCP/HAp) com diferentes proporções (β-TCP/HAp), carregados com um fármaco modelo, a dexametasona (DEX), e procedeu-se à sua incorporação em matrizes de quitosano (CH) reforçadas com um agente reticulante, o glutaraldeído. As matrizes foram obtidas por congelamento e liofilização. A estrutura morfológica dos scaffolds e a evolução das fases cristalinas foram examinadas por microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e difração de raio-X (DRX) respetivamente. Utilizou-se também a espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) para avaliar as ligações químicas. A porosidade dos scaffolds foi avaliada pelo método de deslocamento do líquido tendo o álcool como o líquido de deslocamento. Os scaffolds foram também submetidos a ensaios de compressão, para determinar a resistência mecânica, avaliando-se o efeito da inclusão de diferentes CaP (grânulos de HAp e bifásicos β-TCP/HAp com diferentes proporções) e da incorporação do glutaraldeído nas propriedades mecânicas. Obtiveram-se scaffolds com porosidade superior a 75% e tamanho de poro na gama de 50-500μm e verificou-se que a presença de glutaraldeído (GA) e a incorporação de grânulos de CaP na matriz polimérica de CH aumentam a sua resistência mecânica. Verifica-se ainda uma melhoria da resistência à compressão e do módulo de Young dos scaffolds com o aumento do teor em β-TCP, aumentando a resistência de compressão de 0,11MPa para 0,45MPa e o módulo de Young de 0,27 para 2,79MPa com a incorporação de grânulos bifásicos com um teor elevado (70%) de β-TCP. Construíram-se perfis de libertação da DEX em solução tampão de fosfatos (PBS) por determinação da sua concentração por espetroscopia no ultravioleta visível (UV/Vis) a um comprimento de onda de 242 nm. Efetuaram-se também ensaios de bioatividade em soluções simuladoras do plasma humano (SBF) para se avaliar a formação de camada apatítica, determinando-se as concentrações de cálcio (Ca) e fósforo (P) por plasma de acoplamento indutivo (ICP). O estudo do comportamento bioativo dos scaffolds evidenciou o contributo das partículas de CaP para a bioatividade do scaffold. Os scaffolds compósitos em que coexistem β-TCP e HAp evidenciaram um perfil de libertação de fármaco mais lento e bioatividade superior à dos scaffolds compósitos de HAp. Avaliou-se o comportamento de culturas celulares da linha MG-63 na presença dos diferentes scaffolds, num modelo de cultura indireto, para avaliação da proliferação/viabilidade e morfologia celulares. A proliferação/viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio do MTT. A inclusão de fosfatos de cálcio nos scaffolds de quitosano pareceu melhorar o seu desempenho biológico, verificando-se que nos scaffolds compósitos com grânulos bifásicos a proporção de βTCP/HAp de 50:50 pareceu induzir a resposta biológica mais adequada. Os scaffolds produzidos no presente trabalho apresentam-se pois como estruturas promissoras para aplicação em ET ósseo e simultaneamente como sistemas de libertação controlada de fármacos.

One of the big challenges in tissue engineering (TE) is the development of threedimensional porous structures (scaffolds) to enable cell adhesion and proliferation and the production of extracellular matrix at a rate equal to the degradation rate of the scaffold. For some biomedical applications, the degradation behavior of synthetic hydroxyapatite can be very slow and calcium phosphates (CaP) with a higher rate of resorption may be required in order to speed up the process of bone replacement. Therefore, β-tricalcium phosphate (β-TCP) and hydroxyapatite (HAp) compounds, the so-called biphasic calcium phosphate (BCP), which combine the excellent bioactivity of HAp with the good resorption rate of β-TCP are interesting candidates for bone replacement and for controlled drug release systems. In the present study three types of CaP granules, i.e. HAp and biphasic (β-TCP/HAp) of varying proportions, loaded with a model drug, dexamethasone (DEX), were obtained by spray-drying and incorporated in chitosan (CH) matrices reinforced with a crosslinking agent, the glutaraldehyde. The matrices were obtained by freezing and lyophilization. The morphology of the scaffolds and the development of crystalline phases were characterized by scanning electron microscopy (SEM) and X-ray diffraction (XRD) respectively. Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR) was also used to identify the chemical bonds. Porosity was evaluated by a displacement fluid measurement, using alcohol as the displacement liquid. The scaffolds were submitted to compression tests to evaluate their mechanical strength, and the effect of different CaP (HAp granules and biphasic (β-TCP/Hap) of varying proportions) and of glutaraldehyde incorporation on their mechanical properties was estimated. Macroporous scaffolds with a pore size ranging from of 50 to 500μm, and porosity higher than 75% were obtained and the presence of glutaraldehyde (GA) and the CaP granules incorporation on the polymer matrix revealed to enhance the mechanical strength of the scaffolds. Furthermore, an improvement in the compressive strength and in the Young's modulus of the scaffolds with the increase of β-TCP content is observed: when biphasic granules with a high content (70%) of β-TCP are incorporated into the CH scaffolds the compressive strength increases from 0.11 MPa to 0.45 MPa and the Young's modulus from 0.27 to 2.79Mpa. The release profiles of DEX were determined in phosphate-buffered solution (PBS) and the evaluation of DEX concentration in the releasing medium was carried out by ultraviolet visible (UV/V) spectroscopy at the wavelength of 242 nm. Bioactivity studies were performed in simulated body fluid (SBF) solutions to evaluate the formation of the apatitic layer, and inductively coupled plasma spectroscopy (ICP) was used to monitor the Ca and P concentration variations in SBF solutions. CaP granules revealed to play a significant influence on the bioactivity of the CH scaffolds engineered with a CaP based drug delivery system. Besides, composite scaffolds where biphasic granules are present revealed a slower release drug profile and higher bioactivity than the composite scaffolds of CH with HAp. The behavior of MG-63 cell cultures in the presence of the different scaffolds was evaluated by an indirect culture model for the assessment of cells proliferation/viability and morphology. The proliferation / cell viability was assessed by MTT assay. The incorporation of calcium phosphates in the chitosan scaffolds seemed to improve their biological performance. Furthermore, a (β-TCP/HAp) ratio equal to (50/50) of the biphasic granules in the composite scaffolds appeared to induce the most appropriate biological reaction. The scaffolds produced in this work were found to be promising for application in both ET and controlled release systems for drugs.