The role of exogenous DJ-1 in neuroprotection

Abstract

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa progressiva mais comum e afeta profundamente o movimento. A DP é patologicamente caracterizada pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta que leva a um decréscimo de dopamina no estriado. Apesar de pouco conhecida, a etiologia da DP parece envolver fatores genéticos e ambientais, correspondendo 10% dos casos a formas monogénicas da doença. Mutações na proteína DJ-1 têm sido relacionadas com a patogénese da doença e o interesse no estudo desta proteína tem vindo a crescer ao longo dos anos. Vários estudos mostram um envolvimento direto e indireto da DJ-1 nos mecanismos de neuroprotecção contra o stress oxidativo. Esta proteína foi encontrada em muitos tipos de células, incluindo neurónios e células da glia, com uma distribuição generalizada pelos diferentes compartimentos sub-celulares. Para além disso, a DJ-1 é secretada pelos astrócitos, mas o mecanismo pelo qual esta conferirá neuroproteção aos neurónios adjacentes é ainda desconhecido. Algumas das hipóteses que permanecem em aberto são: a internalização da DJ-1 oriunda dos astrócitos pelos neurónios para exercer os seus mecanismos de neuroprotecção no espaço intracelular; e a ativação de recetores membranares e de vias de sinalização celular. Este estudo pretende revelar algumas pistas sobre os mecanismos de neuroprotecção da DJ-1, usando uma proteína recombinante adicionada exogenamente a células SH-SY5Y. A proteína dimérica produzida revelou um efeito neuroprotetor em células SH-SY5Y sob condições de stress oxidativo. A adição desta proteína, em condições normais ou sob stress oxidativo, levou ainda à ativação das vias de sinalização Akt e ERK1/2. Neste estudo não se observou a internalização da DJ-1 em células SHSY5Y nem a sua interação com nenhuma proteína membranar, permanecendo por explicar o mecanismo neuroprotetor que a DJ-1 secretada pelos astrócitos exerce nos neurónios. De forma a identificar possíveis interactores extracelulares, isto é, proteínas com as quais a DJ-1 interaja no espaço extracelular, foi feito um ensaio de ‘pull-down’ seguido de uma análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa. Este primeiro ensaio permitiu a identificação de algumas proteínas interessantes, incluindo proteínas de adesão, proteínas envolvidas em processos celulares, como a orientação axonal, migração e proliferação celular, metabolismo dos carbohidratos, processos sinápticos e regulação positiva ou negativa de vias de sinalização celular. Os hipotéticos interactores deverão ser validados em estudos futuros, mas poderão ser uma ferramenta importante na compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na DP.

Parkinson’s disease (PD) is the second most common progressive neurodegenerative disorder and profoundly affects movement. PD is pathologically characterized by the degeneration of the dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta leading to loss of dopamine in the striatum. The etiology of PD is not well understood but seems to involve both genetic and environmental factors, and 10% of the cases correspond to monogenic forms of the disease. Mutations in DJ-1 protein have been linked to the pathogenesis of PD, with a growing interest in the study of this protein over the last years. Several studies have shown a direct and indirect involvement of this protein in neuroprotection mechanisms against oxidative stress insults. DJ-1 was found in different cell types, including neurons and glial cells, with a widespread sub-cellular distribution. Furthermore, DJ-1 has also been shown to be secreted by astrocytes, but its neuroprotective role underlying this process is still not understood. Some hyposthesis of DJ- 1 neuroprotective mechanisms include triggering neuronal internalization of the protein and receptor-mediated activation of signalling pathways. This study intended to give some clues about these mechanisms possibly involved in neuroprotection by using a recombinant DJ-1 exogenously added to SH-SY5Y cells. The dimeric produced protein had a neuroprotective effect in cultured SH-SY5Y cells under oxidative stress conditions. Moreover, although preliminary results, the exogenously addition of this protein, under normal or oxidative stress conditions, activated the Akt and the ERK1/2 signaling pathways in the same cell line. On the other hand, there was no evidence for a DJ-1 uptake by the neuroblastoma cells, as there was also no evidence for any interaction of DJ-1 with membrane proteins, so DJ-1 must be exerting its neuroprotective effect outside of cells, probably not needing to be internalized by neurons after its secretion from astrocytes. In order to find some possible extracellular DJ-1 interactors a pull-down assay followed by LC-MS/MS analysis was performed. This preliminary approach allowed the identification of some interesting proteins, including cell adhesion proteins, proteins involved in cellular processes, such as, axon guidance, cell migration and proliferation, carbohydrate metabolism, synaptic process and positive or negative regulation of signalling pathways. The identified putative DJ-1 interactors must be validated, but can be an usefull tool to understand the molecular mechanisms that lead to PD.