Optimal sample size for assessing bacterioneuston structural diversity

Abstract

The surface microlayer (SML) is located at the interface atmospherehydrosphere and is theoretically defined as the top millimeter of the water column. However, the SML is operationally defined according to the sampling method used and the thickness varies with weather conditions and organic matter content, among other factors. The SML is a very dynamic compartment of the water column involved in the process of transport of materials between the hydrosphere and the atmosphere. Bacterial communities inhabiting the SML (bacterioneuston) are expected to be adapted to the particular SML environment which is characterized by physical and chemical stress associated to surface tension, high exposure to solar radiation and accumulation of hydrophobic compounds, some of which pollutants. However, the small volumes of SML water obtained with the different sampling methods reported in the literature, make the sampling procedure laborious and time-consuming. Sample size becomes even more critical when microcosm experiments are designed. The objective of this work was to determine the smallest sample size that could be used to assess bacterioneuston diversity by culture independent methods without compromising representativeness and therefore ecological significance. For that, two extraction methods were tested on samples of 0,5 mL, 5 mL and 10 mL of natural SML obtained at the estuarine system Ria de Aveiro. After DNA extraction, community structure was assessed by DGGE profiling of rRNA gene sequences. The CTAB-extraction procedure was selected as the most efficient extraction method and was later used with larger samples (1 mL, 20 mL and 50 mL). The DNA obtained was once more analyzed by DGGE and the results showed that the estimated diversity of the communities does not increase proportionally with increasing sample size and that a good estimate of the structural diversity of bacterioneuston communities can be obtained with very small samples.

A microcamada superficial marinha (SML) situa-se na interface atmosferahidrosfera e teoricamente é definida como o milímetro mais superficial da coluna de água. Operacionalmente, a espessura da SML depende do método de amostragem utilizado e é também variável com outros fatores, nomeadamente, as condições meteorológicas e teor de matéria orgânica, entre outros. A SML é um compartimento muito dinâmico da coluna de água que está envolvida no processo de transporte de materiais entre a hidrosfera e a atmosfera. As comunidades bacterianas que habitam na SML são designadas de bacterioneuston e existem indícios de que estão adaptadas ao ambiente particular da SML, caracterizado por stresse físico e químico associado à tensão superficial, alta exposição à radiação solar e acumulação de compostos hidrofóbicos, alguns dos quais poluentes de elevada toxicidade. No entanto, o reduzido volume de água da SML obtidos em cada colheita individual com os diferentes dispositivos de amostragem reportados na literatura, fazem com que o procedimento de amostragem seja laborioso e demorado. O tamanho da amostra torna-se ainda mais crítico em experiências de microcosmos. O objectivo deste trabalho foi avaliar se amostras de pequeno volume podem ser usadas para avaliar a diversidade do bacterioneuston, através de métodos de cultura independente, sem comprometer a representatividade, e o significado ecológico dos resultados. Para isso, foram testados dois métodos de extracção em amostras de 0,5 mL, 5 mL e 10 mL de SML obtida no sistema estuarino da Ria de Aveiro. Após a extracção do DNA total, a estrutura da comunidade bacteriana foi avaliada através do perfil de DGGE das sequências de genes que codificam para a sub unidade 16S do rRNA. O procedimento de extracção com brometo de cetil trimetil de amônia (CTAB) foi selecionado como sendo o método de extração com melhor rendimento em termos de diversidade do DNA e mais tarde foi aplicado a amostras de maior dimensão (1 mL, 20 mL e 50 mL). O DNA obtido foi mais uma vez usado para análise dos perfis de DGGE de 16S rDNA da comunidade e os resultados mostraram que a estimativa da diversidade de microorganismos não aumentou proporcionalmente com o aumento do tamanho da amostra e que com amostras de pequeno volume podem ser obtidas boas estimativas da diversidade estrutural das comunidades de bacterioneuston.