Photoinactivation of viruses by porphyrins

Abstract

A inativação fotodinâmica tem sido usada com sucesso na inativação de microorganismos. Diversos aspetos da inativação fotodinâmica foram já estudados para diferentes microrganismos, contudo, existe ainda pouca informação disponível no que diz respeito à inativação de bacteriófagos por processos fotodinâmicos. Este trabalho pretendeu elucidar e avaliar vários aspetos da fotoinativação de vírus, em particular de bacteriófagos, incluindo (i) o efeito de diversos parâmetros de luz utilizados na fotoinativação de bacteriófagos; (ii) a eficiência da inativação fotodinâmica de diferentes tipos de bacteriófagos (fagos do tipo DNA e RNA); (iii) o principal mecanismo através do qual a inativação fotodinâmica tem lugar; (iv) o efeito da fotoinativação nas proteínas do bacteriófago; e (v) o possível desenvolvimento de resistência e recuperação da viabilidade após vários tratamentos fotodinâmicos consecutivos. Para avaliar o efeito dos diferentes parâmetros de luz, suspensões fágicas com 107 UFP mL-1 foram irradiadas com diferentes fontes e doses de luz, intensidades luminosas e tempos de irradiação (30,90 e 270 min) na presença de 0,5; 1,0 e 5,0 μM dos derivados porfirínicos catiónicos Tri- Py+-Me-PF e Tetra-Py+-Me. A eficiência da fotoinativação de diferentes fagos do tipo DNA e RNA, foi avaliada através da irradiação da suspensão fágica com luz branca (40 W m-2) durante 270 min na presença de 0,5 e 5,0 μM do derivado porfirínico Tri-Py+-Me-PF, respetivamente para os fagos do tipo RNA e DNA. O mecanismo através do qual a fotoinativação de fagos de DNA (fago do tipo T4) e de RNA (fago Qb) tem lugar foi avaliado por exposição da suspensão fágica à luz branca com uma potência de 40 W m-2, na presença de fotossensibilizador (Tri-Py+-Me-PF e Tetra-Py+-Me) e inibidores, quer do oxigénio singuleto (azida de sódio e L-histidina) quer de radicais livres (Dmanitol e L-cisteína). Os danos nas proteínas do fago do tipo T4, induzidos pelas espécies reativas de oxigénio geradas por 5,0 μM Tri-Py+-Me-PF, foram avaliados pelo método convencional de SDS-PAGE e por espectroscopia de infravermelho. O possível desenvolvimento de resistência e recuperação da viabilidade após a inativação fotodinâmica dos bacteriófagos foi avaliado após dez ciclos consecutivos de tratamento fotodinâmico incompletos (120 min sob irradiação de luz branca a uma potência de 40 W m-2) na presença de 5,0 μM do derivado porfirínico Tri-Py+-Me-PF. Os resultados deste trabalho mostraram que (i) quando uma quantidade de energia (dose de luz) determinada foi aplicada numa suspensão fágica, a partir de uma mesma fonte irradiação, a fotoinactivação do fago foi tanto mais eficiente quanto mais baixa foi a potência luminosa aplicada; (ii) os bacteriófagos foram eficientemente inativados até ao limite de deteção (redução de 6-7 log); (ii) os fagos do tipo RNA foram inativados mais facilmente do que os fagos do tipo DNA (tempos de exposição mais curtos e com concentração de fotossensibilizador dez vezes menor do que a usada para inativar os fagos do tipo DNA); (iii) o mecanismo do tipo II (via produção de oxigénio singuleto) foi o principal mecanismo através do qual a fotoinativação dos bacteriófagos teve lugar; (iv) foi possível detectar danos no perfil proteico após tratamento fotodinâmico e a espectroscopia de infravermelho apresentou-se como uma metodologia promissora de screening para avaliação dos danos induzidos pela inativação fotodinâmica em proteínas; e (v) após dez ciclos consecutivos de tratamento fotodinâmico, o fago do tipo T4 não revelou nenhum tipo de resistência ao tratamento fotodinâmico nem recuperou a sua viabilidade. Como conclusão, a inativação fotodinâmica microbiana é uma tecnologia bastante eficaz para a fotoinativação de bacteriófagos do tipo DNA e RNA sem invólucro, a qual pode ser considerada como uma alternativa ao tratamento convencional com agentes antivíricos, mesmo com intensidades luminosas baixas, sem o risco associado de desenvolvimento de mecanismos de resistência.

Microbial photodynamic inactivation (PDI) has been successfully used to inactivate microorganisms. PDI has already been studied under different conditions for different microorganisms; however, there is still scarce information about bacteriophage inactivation by photodynamic procedures. The goal of this study was to elucidate and evaluate several aspects of viral PDI which include (i) the effect of different light sources, doses and intensities on phage inactivation; (ii) the photoinactivation efficiency on different types of bacteriophages (DNA- and RNA-type phages), (iii) the main mechanism by which phage photosensitization takes place, (iv) the effect of PDI on phage proteins; and (v) the possibility of resistance development and viability recovery after consecutive phototreatments. To evaluate the efficiency of photoinactivation, T4-like phage suspensions of 107 PFU mL-1 were exposed to different light sources(fluorescent PAR lamps, solar light and halogen lamp), and fluence rates (40 W m-2, 600 W m-2 and 1690 W m-2) during 30, 90 and 270 min in the presence of 0.5, 1.0 and 5.0 μM of the cationic porphyrin derivatives Tri-Py+-Me-PF and Tetra-Py+-Me. DNA- and RNA-type phages were exposed to white light (40 W m-2) during 270 min in the presence of Tri-Py+-Me-PF at the concentrations of 0.5 and 5.0 μM, respectively for RNA- and DNA-type phages. The mechanism of phage inactivation was evaluated for DNA- (T4-like) and RNA-type (Qb) phages, in the presence of photosensitizer (Tri-Py+-Me-PF and Tetra-Py+-Me) and singlet oxygen quenchers (sodium azide and L-histidine) and free radicals scavengers (D-mannitol and L-cysteine). The damages on T4- like phage proteins, induced by the ROS generated by Tri-Py+-Me-PF, were assessed by the conventional SDS-PAGE analysis and by IR spectroscopy. Ten consecutive and incomplete (120 min of irradiation at 40 W m-2) cycles of T4-like phage photosensitization by 5.0 μM Tri-Py+-Me-PF were also performed in order to determine the possible development of resistance and viability recovery after phage PDI. From this study it can be concluded that (i) considering the same light source and a fixed light dose, applied at different fluence rates, phage photoinactivation was significantly higher when low fluence rates were used at long irradiation times; (ii) the phages were efficiently inactivated to the detection limit (reductions of 6-7 log); (ii) RNA-type phages were much more easily inactivated than the DNA-type ones (sooner and with ten times less porphyrin concentration than that used for DNA-type phages); (iii) type II mechanism (production of singlet oxygen) was the main mechanism by which phage photosensitization took place; (iv) IR spectroscopy represents a promising and fast-screening methodology when the damages induced by photosensitization on phage proteins are to be studied; and (v) after ten consecutive photodynamic cycles, T4-like phage did not exhibit any resistance to PDI nor recovered its viability. In conclusion, viral PDI is a very efficient technology for the inactivation of non-enveloped DNA- and RNA-type phages, which may be used as an alternative to the conventional antiviral treatments, even at low light fluence rates, without the problem of viral resistance.