Estudo do papel da (Na+/K+)ATPase na acção neurotóxica do alumínio

Abstract

O alumínio é um agente neurotóxico cujo mecanismo de acção permanece por esclarecer. A (Na+/K+)ATPase é avaliada em estudos neurotoxicológicos, como indicador da actividade da membrana plasmática das células nervosas. Esta enzima hidrolisa ATP e estabelece e mantém os gradientes de K+ e Na+ através da membrana plasmática de todas as células eucarióticas. Quando integrada na membrana, a (Na+/K+)ATPase apresenta uma estrutura oligomérica (αβ)n assegurada pela interacção dum número variável de protómeros . O padrão de expressão das isoformas das subunidades e é característico de cada tipo de célula, conferindo características distintas à actividade de (Na+/K+)ATPase, nomeadamente a sensibilidade ao inibidor selectivo ubaína. Este trabalho pretende evidenciar a participação da (Na+/K+)ATPase no mecanismo de acção neurotóxica do alumínio e caracterizar o efeito inibitório do alumínio na actividade de (Na+/K+)ATPase. A administração, por via oral, de 120 mg de AlCl3/kg de peso corporal aumentou transitoriamente a concentração de Al3+ na circulação sistémica, na urina e nas fezes do rato Wistar macho, jovem e adulto. A exposição prolongada a AlCl3 [3,6 g durante 120 dias (0,03 g/dia)] provocou um aumento de ~7 ng Al3+/mg de proteína nos terminais pré-sinápticos isolados (sinaptossomas) do córtex cerebral e a inibição (30%) da actividade de (Na+/K+)ATPase. O efeito inibitório do alumínio também foi verificado nos ensaios in vitro, revelando-se dependente da concentração de AlCl3 no meio de reacção. A inibição da (Na+/K+)ATPase pela acção do alumínio, in vivo e in vitro, impede a activação adicional por concentrações elevadas de ATP, reduzindo a velocidade máxima da reacção hidrolítica. O efeito inibitório só foi observado na presença de concentrações saturantes de ATP e parece implicar a diminuição do grau de oligomerização da enzima, diminuindo o número de protómeros que constituem a estrutura oligomérica da proteína integrada na membrana. A exposição in vivo a AlCl3 inibiu as isoenzimas do cérebro e do rim, sem modificar o padrão de expressão da subunidade α da (Na+/K+)ATPase. A análise da dependência da actividade enzimática em função da concentração de ubaína demonstrou a inibição por alumínio de todas as isoenzimas. Por análise densitométrica das proteínas imunodetectadas com anticorpos específicos, não se registaram alterações na expressão das subunidades α1, α2 e α3. In vivo e in vitro, o efeito do alumínio na (Na+/K+)ATPase mantém as suas características principais. Enquanto que a análise da fluidez de membrana, da razão molar colesterol/fosfolípidos totais e do balanço prooxidante-antioxidante nos sinaptossomas revelou que, após exposição in vivo a alumínio, estes parâmetros apresentam alterações distintas das induzidas pela presença de alumínio no meio de reacção (in vitro). A inibição da (Na+/K+)ATPase parece ocorrer na fase inicial da acção neurotóxica do alumínio, porque não foram observadas evidências de morte celular/disrupção da membrana, de diminuição de energia e de alteração do gradiente transmembranar de Na+ nos sinaptossomas do córtex cerebral do rato. A ultra-estrutura dos sinaptossomas, bem como a libertação da lactato desidrogenase, os níveis dos nucleótidos de adenina endógenos, a razão ATP/ADP, o potencial de carga energética adenílica e a acumulação do ácido-aminobutírico mantiveram-se inalterados após a exposição oral a 3,6 g de AlCl3 durante 120 dias (0,03 g/dia).

Aluminium is a neurotoxic agent, but its mechanism of action remains unclear. Within the context of neurotoxicological studies, (Na+/K+)ATPase activity is evaluated as an indicator of nervous cells plasma membrane function. This enzyme hydrolyses ATP and establishes and maintains the K+ and Na+ gradients across the plasma membrane of all eukaryotic cells. Within the plasma membrane, (Na+/K+)ATPase presents an oligomeric structure (αβ) nensured by the interaction of a variable number of protomers. The expression patterns of α and β subunit isoforms are cell-specific, which award distinct characteristics to (Na+/K+)ATPase activity, namely the sensitivity to the selective inhibitor ouabain. The aim of this work is to show the involvement of (Na+/K+)ATPase in aluminium neurotoxicity and to characterize the aluminium inhibitory effect on (Na+/K+)ATPase activity. The oral administration of 120 mg of AlCl3/kg of body weight transiently increased aluminium concentration in blood, urine and faeces of young adult male Wistar rat. The long-term exposition to AlCl3 [3.6 g during 120 days (0.03 g/day)] induced an increase of ~7 ng Al3+/mg of protein in the total aluminium concentration of the presynaptic nerve terminals (synaptosomes) isolated from rat brain cortex and induced the inhibition (30%) of (Na+/K+)ATPase activity. The aluminium inhibitory effect on the synaptosomal (Na+/K+)ATPase activity was also observed during in vitro assays, and it was dependent on the AlCl3 concentration in the reaction medium. The in vivo and in vitro aluminium inhibitory action on (Na+/K+)ATPase reduces the additional activation of membrane-bound (Na+/K+)ATPase by high ATP concentrations, dropping the maximal velocity of the hydrolytic reaction. The inhibitory effect was only observed in the presence of ATP saturating concentrations, and it seems to implicate the reduction of enzyme oligomerization, diminishing the number of interacting protomers within the oligomeric ensemble of the membrane-bound (Na+/K+)ATPase. The administration of AlCl3 (0.03 g/day), during 120 days, inhibited brain and kidney isozymes, without modifying the expression patterns of the (Na+/K+)ATPase catalytic subunit (α). The aluminium-induced inhibition of all isozymes was demonstrated by the analysis of the enzyme activity in the presence of increasing concentrations of ouabain. By densitometric analysis of immunodetected proteins with antibodies that bind to specific sequences of α1, α2 and α3 subunits, no significant changes in protein expression were observed. The in vivo and in vitro aluminium effects on (Na+/K+)ATPase share the same main characteristics. Conversely, the analysis of membrane fluidity, cholesterol/total phospholipids molar ratio and prooxidant-antioxidant balance in the synaptosomal fraction revealed that the alterations of these parameters upon in vivo aluminium exposition are distinct from those observed when aluminium is present in the reaction medium (in vitro). The (Na+/K+)ATPase inhibition seems to occur during the initial phase of the aluminium neurotoxic action, since no evidences of cell death/membrane disruption, reduction of energy and alteration of transmembrane Na+ gradient in the synaptosomes, isolated from the brain cortex of young adult male Wistar rat, were observed. The ultrastructure of synaptosomes, as well as lactate dehydrogenase leakage, endogenous adenine nucleotides levels, ATP/ADP ratio, energy charge potential and uptake of -aminobutyric acid, remained unchanged after oral exposition to 3.6 g of AlCl3 during 120 days (0.03 g/day).