Autosomal dominant polycystic kidney disease - genetic diagnosis

Abstract

A doença renal poliquística autossómica dominante (ADPKD) é uma doença hereditária e monogénica comum que resulta no desenvolvimento de quistos renais que aumentam em tamanho e em número com o avanço da idade, muitas vezes conduzindo ao aparecimento da doença renal terminal. Cerca de 85% dos casos identificados são causados por mutações no gene PKD1, um gene complexo de elevadas dimensões (~ 47kb). Atualmente, a sequenciação completa do gene PKD1 permite, com elevada sensibilidade, detetar variantes alélicas e pode ser utilizada em determinadas situações clínicas para as quais as técnicas radiológicas não permitem obter um diagnóstico clínico definitivo. No entanto, o rastreio de mutações é muitas vezes inconclusivo devido à presença de várias cópias homólogas a este gene localizadas no cromossoma 16, e à elevada heterogeneidade alélica do PKD1. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um teste genético de diagnóstico para a ADPKD através da sequenciação da zona codificante e limites intrão/exão do gene PKD1, utilizando a tecnologia de Sanger e otimizado para amostras de sangue armazenadas em cartões FTA™. Procedeu-se à otimização da amplificação e sequenciação, das regiões de interesse, utilizando a tecnologia de BigDye™ Terminator V3.1 e o protocolo desenvolvido mostrou ser uma metodologia reprodutível. Mutações patogénicas foram rastreadas em amostras de dois indivíduos, não relacionados, com ADPKD. Num dos pacientes a análise revelou a presença de uma mutação causadora de um codão stop prematuro no exão 15, no segundo paciente foi detetada uma deleção de 19pb no intrão 31, originando uma alteração na frame de leitura e causando a terminação prematura da proteína. Além disso, a heterogeneidade do PKD1 foi verificada uma vez que foram detetadas várias variantes neutras nas amostras analisadas, sendo que três destas alterações resultaram em alteração de aminoácido. Este estudo demonstrou o potencial da sequenciação de Sanger no diagnóstico de doenças genéticas. Apesar de futuramente ser necessária a validação com mais amostras de pacientes com ADPKD, é possível concluir que a metodologia desenvolvida poderá conduzir a um diagnóstico genético eficaz.

Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD) is a common hereditary and monogenic disorder that results in renal cysts development that increases in number and size as the person gets older, often leading to end- stage renal disease. PKD1 is a large (~47kb) and complex gene that accounts for 85% of the identified cases of ADPKD. Currently, the full sequencing of PKD1 allows, with high sensibility, the detection of variations along the gene and this may be used in certain clinicai situations where imaging cannot provide a definitive clinicai diagnosis. However, the screening of mutation is often inconclusive because of multiple homologous copies of this gene on chromosome 16 and the high levei of allelic heterogeneity of PKD1. The research presented here had the objective to develop a genetic diagnostic test for ADPKD through PKD1 coding region and exon/intron boundaries sequencing, using Sanger technology and optimized for blood samples in FTA™ cards. The amplification and sequencing, using BigDye™ Terminator V3.1 technology, were optimized for the regions of interest, and the methodology showed to be reproducible. The screening for disease-causing mutations was performed in two unrelated individuais with ADPKD. The analysis revealed the presence of a truncating mutation in exon 15 in one of the patients, and a 19bp deletion in intron 31 of the other patient, which led to frameshifting and premature termination. In addition, the heterogeneity of PKD1 was observed, since there were detected several neutral variants in the analyzed samples, three of which resulting in amino acid substitution. This research demonstrated the potential of automated Sanger sequencing for diagnosis of genetic diseases. Although further validation using more samples from ADPKD patients is still needed, it is possible to conclude that this approach can lead to an effective molecular genetic diagnosis.