Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/10390
Title: Quantification of amino acids misincorporation in recombinant proteins
Other Titles: Quantificação de erros de incorporação em proteínas recombinantes
Author: Alam, Mohammad Zahangir
Advisor: Santos, Manuel António da Silva
Keywords: Biologia molecular
Proteínas - Síntese química
Proteínas recombinantes
Aminoácidos
Defense Date: 30-Jul-2012
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: A síntese de proteínas de acordo com o código genético é essencial para manter proteoma estável e para a homeostase celular. No entanto, os erros podem ocorrer naturalmente durante a síntese da proteína a partir do seu mRNA, variando entre 10-3 a 10-4 erros por codão. Estes erros ocorrem com mais frequncia em proteínas recombinantes sobre-expressas em hospedeiros heterólogos. Quantidades crescentes de proteína não-funcional estão geralmente relacionados à tradução em condições de stress. Neste estudo utilizou-se Saccharomyces cerevisiae como um organismo hospedeiro para expressar o gene lacZ-GST para quantificar o erro de tradução. A levedura foi tratada com diversos agentes de stress tais como o etanol, o crómio (CrO3), e aminoglicósido antibiótico - geneticina (G418). A incorporação de erros foi estudada em proteína solúvel e insolúvel para determiner se os erros de tradução aumentam a agregação de proteína. Usando esta abordagem, verificou-se que o stress aumenta o erro de tradução para níveis de 5.6 × 10-3 a 8 × 10-3, 60 - 80 vezes mais que o nível normal. Esta taxa de erro inesperadamente elevada tem implicações para a utilização terapêutica de proteínas recombinantes.
The synthesis of protein according to genetic code of a gene determines the basis of life and a stable proteome is necessary for cell homeostatis. Faithful translation of protein give gurantee of cell survival. However, errors occur naturally during translation of protein from its mRNA, which varies from 10-3 to 10-4 per codon. These errors are more frequent in recombinant protein overexpressed in heterologous hosts and affect protein functionality. The increasing amount of nonfunctional protein is often related to mistranslation of a gene under stress. In the present study, we used Saccharomyces cerevisiae as a host organism to overexpress E. coli lacZ gene fusion with GST to quantify misincorporation of amino acid in GST-β galactosidase recombinant protein. The yeast was treated with various stressors such as ethanol, chromium (CrO3), and aminoglycoside antibiotic - geneticin (G418) to induce protein aggregation. The misincorporation of amino acids was studied in both soluble and insoluble protein fractions by mass-spectrometry to determine how much misincorporation occur and whether this is associated with protein insolubility. We found that under experimental stress conditions the misincorporation of amino acids ranges from 5.6 × 10-3 to 8 × 10-3, which represents 60-80 fold higher than reported level. The unexpectedly high error rate has implications for the therapeutic use of the heterologous host derived recombinant proteins.
Description: Mestrado em Biologia Molecular Celular
URI: http://hdl.handle.net/10773/10390
Appears in Collections:DBio - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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