Genotoxic risk of herbicides to Anguilla anguilla L.

Abstract

No contexto dos contaminantes aquáticos, os herbicidas são considerados como um dos grupos mais perigosos. Uma vez aplicados, estes são facilmente transportados para cursos de água, quer devido a uma pulverização pouco cuidada ou devido a fenómenos de escorrência superficial e/ou subterrânea. A presença destes agroquímicos no ambiente tem vindo a ser associada a efeitos nefastos em organismos não-alvo, como é o caso dos peixes. Contudo, existe ainda uma grande lacuna no que diz respeito à informação científica relacionada com o seu impacto genotóxico. Deste modo, a presente tese foi delineada com o intuito de avaliar o risco genotóxico em peixes de duas formulações de herbicidas: o Roundup®, que tem como princípio activo o glifosato, e o Garlon®, que apresenta o triclopir na base da sua constituição, produtos estes largamente utilizados na limpeza de campos agrícolas, assim como em florestas. Foi ainda planeado desenvolver uma base de conhecimento no que diz respeito aos mecanismos de dano do ADN. Como último objectivo, pretendeu-se contribuir para a mitigação dos efeitos dos agroquímicos no biota aquático, nomeadamente em peixes, fornecendo dados científicos no sentido de melhorar as práticas agrícolas e florestais. Este estudo foi realizado adoptando a enguia europeia (Anguilla anguilla L.) como organismo-teste, e submetendo-a a exposições de curta duração (1 e 3 dias) dos produtos comerciais mencionados, em concentrações consideradas ambientalmente realistas. Para a avaliação da genotoxicidade foram aplicadas duas metodologias: o ensaio do cometa e o teste das anomalias nucleares eritrocíticas (ANE). Enquanto o ensaio do cometa detecta quebras na cadeia do ADN, um dano passível de ser reparado, o aparecimento das ANE revela lesões cromossomais, sinalizando um tipo de dano de difícil reparação. O ensaio do cometa foi ainda melhorado com uma nova etapa que incluiu a incubação com enzimas de reparação (FPG e EndoIII), permitindo perceber a ocorrência de dano oxidativo no ADN. No que diz respeito ao Roundup®, o envolvimento do sistema antioxidante como indicador de um estado próoxidante foi também alvo de estudo. Uma vez que as referidas formulações se apresentam sob a forma de misturas, o potencial genotóxico dos seus princípios activos foi também avaliado individualmente. No caso particular do Roundup®, também foram estudados o seu surfactante (amina polietoxilada; POEA) e o principal metabolito ambiental (ácido aminometilfosfórico; AMPA). Os resultados obtidos mostraram a capacidade do Roundup® em induzir tanto dano no ADN (em células de sangue, guelras e fígado) como dano cromossómico (em células de sangue). A investigação sobre o possível envolvimento do stresse oxidativo demonstrou que o tipo de dano no ADN varia com as concentrações testadas e com a duração da exposição. Deste modo, com o aumento do tempo de exposição, os processos relacionados com o envolvimento de espécies reactivas de oxigénio (ERO) ganharam preponderância como mecanismo de dano no ADN, facto que é corroborado pela activação do sistema antioxidante observado nas guelras, assim como pelo aumento dos sítios sensíveis a FPG em hepatócitos. O glifosato e o POEA foram também considerados genotóxicos. O POEA mostrou induzir uma maior extensão de dano no ADN, tanto comparado com o glifosato como com a mistura comercial. Apesar de ambos os componentes contribuirem para a genotoxicidade da formulação, a soma dos seus efeitos individuais nunca foi observada, apontando para um antagonismo entre eles e indicando que o POEA não aumenta o risco associado ao princípio activo. Deste modo, realça-se a necessidade de regulamentar limiares de segurança para todos os componentes da formulação, recomendando, em particular, a revisão da classificação do risco do POEA (actualmente classificado com “inerte”). Uma vez confirmada a capacidade do principal metabolito do glifosato – AMPA – em exercer dano no ADN assim como dano cromossómico, os produtos da degradação ambiental dos princípios activos assumem-se como um problema silencioso, realçando assim a importância de incluir o AMPA na avaliação do risco relacionado com herbicidas com base no glifosato. A formulação Garlon® e o seu princípio activo triclopir mostraram um claro potencial genotóxico. Adicionalmente, o Garlon® mostrou possuir um potencial genotóxico mais elevado do que o seu princípio activo. No entanto, a capacidade de infligir dano oxidativo no ADN não foi demonstrada para nenhum dos agentes. No que concerne à avaliação da progressão do dano após a remoção da fonte de contaminação, nem os peixes expostos a Roundup® nem os expostos a Garlon® conseguiram restaurar completamente a integridade do seu ADN ao fim de 14 dias. No que concerne ao Roundup®, o uso de enzimas de reparação de lesões específicas do ADN associado ao teste do cometa permitiu detectar um aparecimento tardio de dano oxidativo, indicando deste modo um decaimento progressivo da protecção antioxidante e ainda uma incapacidade de reparar este tipo de dano. O período de pós-exposição correspondente ao Garlon® revelou uma tendência de diminuição dos níveis de dano, apesar de nunca se observar uma completa recuperação. Ainda assim, foi evidente uma intervenção eficiente das enzimas de reparação do ADN, mais concretamente as direccionadas às purinas oxidadas. A avaliação das metodologias adoptadas tornou evidente que o procedimento base do ensaio do cometa, que detecta apenas o dano nãoespecífico no ADN, possui algumas limitações quando comparado com a metodologia que incluiu a incubação com as enzimas de reparação, uma vez que a última mostrou reduzir a possibilidade de ocorrência de resultados falsos negativos. Os dois parâmetros adoptados (ensaio do cometa e teste das ANE) demonstraram possuir aptidões complementares, sendo assim recomendado a sua utilização conjunta com vista a efectuar uma avaliação mais adequada do risco genotóxico. Globalmente, os resultados obtidos forneceram indicações de grande utilidade para as entidades reguladoras, contribuindo ainda para a (re)formulação de medidas de conservação do ambiente aquático. Neste sentido, os dados obtidos apontam para a importância da avaliação de risco dos herbicidas incluir testes de genotoxicidade. A magnitude de risco detectada para ambas as formulações adverte para a necessidade de adopção de medidas restritivas em relação à sua aplicação na proximidade de cursos de água. Como medidas mitigadoras de impactos ambientais, aponta-se o desenvolvimento de formulações que incorporem adjuvantes selecionados com base na sua baixa toxicidade.

Herbicides are considered among the most hazardous contaminants of water bodies, since they easily reach these ecosystems through aerial spray drift, artificial drainage systems and surface or sub-surface runoff. The occurrence of these agrochemicals in the aquatic environment has been associated to deleterious effects in non-target organisms, namely fish. However, a considerable gap is evident regarding the scientific information on their genotoxic impact. Therefore, the present thesis was designed with the intention to evaluate the genotoxic risk to fish of the herbicide formulations Roundup® (glyphosate-based) and Garlon® (triclopyr-based), representing broadly used products worldwide to manage unwanted vegetation in agriculture and forestry. It was also planned to develop of a biologically base knowledge on DNA damage mechanisms. As ultimate goal, it was intended to contribute to mitigate the effects of agrochemicals in aquatic biota, namely fish, providing scientific data able to improve forestry and agriculture managing practices. The study was carried out adopting the European eel (Anguilla anguilla L.) as test organism and performing short-term exposures (1 and 3 days) to environmentally realistic concentrations of the mentioned commercial products. Two different genotoxic endpoints were adopted: comet and erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) assays. The comet assay measures DNA stand breaks, a repairable type of damage, whereas the ENA assay identifies chromosomal lesions, signalizing a type of damage hardly repairable. The comet assay was also upgraded with an extra-step involving incubation with repair enzymes (FPG and EndoIII), in order to detect oxidative DNA damage. In what concerns to Roundup®, the involvement of the antioxidant system as indication of a pro-oxidant status was also assessed. Once the aforementioned formulations are presented as mixtures of chemicals, the genotoxic potential of their active ingredients individually was also assessed. In the case of Roundup®, the evaluation of the risk associated to the surfactant (polyethoxylated amine; POEA) and to the major environmental breakdown product of the active principle (aminomethylphosphonic acid; AMPA) was carried out as well. The results obtained showed the Roundup® ability to induce both DNA (in blood, gills and liver cells) and chromosomal damage (in blood cells). The investigation on the causative involvement of oxidative stress demonstrated that the type of DNA damage varies with tested concentrations and exposure duration. Thus, ROS-dependent processes gained preponderance as a mechanism of DNA damage with the increase of exposure length, which was corroborated by the antioxidant activation observed in gills as well as the net FPG-sensitive sites elevation detected in liver. Glyphosate and the surfactant POEA were also found to be genotoxic. Moreover, POEA induced the highest extent of DNA damage, when compared to glyphosate and the commercial mixture. Though both components showed to contribute to the overall genotoxicity of the herbicide formulation, the sum of their individual effects was never observed, pointing out an antagonistic interaction between them, indicating that POEA does not increase the risk associated to the active ingredient. These findings also emphasized the need to define regulatory thresholds for all the formulation components, recommending, in particular, the revision of the hazard classification of POEA (classified as “inert” until date). Since the ability of the main environmental metabolite of glyphosate - AMPA - in exert DNA and chromosomal damage was also confirmed, it was pointed out the silent problem that the products of environmental degradation of the active ingredients can constitute. In addition, the importance to include AMPA in risk assessment studies concerning the glyphosate-based herbicides was highlighted. The formulation Garlon® and its active ingredient triclopyr also showed a clear genotoxic potential. In addition, it was demonstrated the higher genotoxicity of the formulation, in comparison to the active ingredient. However, their ability in exert oxidative DNA damage could not be demonstrated. In what concerns to the evolution of the damage progression after removal of the contamination source, neither fish exposed to Roundup® nor Garlon® achieved a complete restoration of DNA integrity in 14 days. In relation to Roundup®, the use of the DNA lesion-specific repair enzymes allowed understanding the occurrence of a late oxidative DNA damage, indicating a progressive decay of cell antioxidant protection as well as the incapacity to repair this particular type of damage. The Garlon® post-exposure period revealed a tendency to decrease damage levels, although not enough to be regarded as an effective recovery. However, an efficient intervention of DNA repair enzymes specifically directed to oxidized purines became evident. Evaluating the performance of the adopted genotoxic endpoints, it was evident that the standard comet procedure, detecting only non-specific DNA damage, displayed some limitations when compared to the methodology that includes the incubation with the repair enzymes, since the latter reduced the possibility of false negative results. The two adopted endpoints (comet and ENA assays) demonstrated complementary aptitudes, being recommended their jointly application since it allows a more effective genotoxic risk assessment. Overall, the results obtained provided useful recommendations for policymaking, contributing to (re)formulate regulatory procedures for protecting the health of aquatic environment. In this direction, the data gathered in this work point to the importance of performing a genotoxic evaluation in order to actually determine the hazard posed by herbicides and their by-products. The magnitude of risk detected for both formulations strongly advise the adoption of restrictive measures in relation to their application in the proximity of watercourses. As mitigation measures, the development of formulations incorporating adjuvants selected on the basis of their lower toxicity emerged as a recommended path.