Mutagénese por transposão no genoma de Aeromonas hydrophila

Abstract

Espécies de Aeromonas são reconhecidas como agentes etiológicos de amplo espetro de doenças em humanos e animais. São muito comuns em águas de consumo e em diferentes tipos de alimentos, especialmente frutos do mar. A resistência de Aeromonas spp. aos antibióticos vulgarmente usados, é um assunto de preocupação, devido à natureza ubíqua desses organismos. A resistência a antibióticos em Aeromonas está relacionada com vários mecanismos, ao passo que, a resistência codificada cromossomicamente por β-lactâmicos é particularmente relevante devido à ampla utilização destes antibióticos. A expressão coordenada de β-lactamases induzidas cromossomicamente é considerada o mecanismo principal de resistência a β- lactâmicos, em Aeromonas sp. No entanto, os mecanismos precisos da sua regulamentação ainda não estão claros. O objetivo deste estudo é a elaboração de uma biblioteca de mutantes para A. hydrophila, com o intuito de identificar novos determinantes genéticos que possam estar envolvidos na regulação do mecanismo de resistência a antibióticos β-lactâmicos, podendo constituir novos alvos de aplicação terapêutica. Os mutantes obtidos foram testados para a suscetibilidade aumentada ou diminuída à ampicilina, cefotaxima e imipenemo. O perfil de sensibilidade foi medido por microdiluição. Uma vez que, foi demonstrado que as células em biofilmes são geralmente mais resistentes à quimioterapia do que as células planctónicas, os mutantes também foram avaliados quanto à sua capacidade de formar biofilmes num ensaio em placa de microtitulação utilizando coloração com violeta de cristal. Esta abordagem permitiu a identificação de 17 mutantes que apresentam fenótipos de resistência alterados: 5 mutantes mostraram aumentar a suscetibilidade ao IMP, 11 apresentaram diminuição da suscetibilidade à CTX e 1 mutante, quando comparado com a estirpe parental, mostrou aumento da suscetibilidade ao IMP e diminuição da suscetibilidade à CTX. Além disso, todos os 17 mutantes apresentaram também alterações reprodutíveis na sua capacidade de formação de biofilme. Por sequenciação da região que flanqueia o transposão de 4 mutantes, foram identificados os genes seguintes que codificam proteínas envolvidas na resistência a β-lactâmicos: uma proteína reguladora da transcrição, uma ATPase, uma GDP-manose 4,6-desidratase e uma proteína hipotética com função desconhecida.

Aeromonas species are recognized as etiological agents of a wide spectrum of diseases in humans and animals. They are very common in drinking waters and in different types of foods, particularly seafood. Resistance of Aeromonas spp. to commonly used antibiotics is a matter of concern due to the ubiquitous nature of these organisms. Antibiotic resistance in Aeromonas is related to several in which the chromosomally encoded resistance to β-lactams is particularly relevant due to the wide use of these antibiotics. The coordinated expression of chromosomally inducible β- lactamases is considered a main mechanism of resistance to β-lactams in Aeromonas sp. Nevertheless, the precise mechanisms of its regulation are still unclear. The objective of this study is to develop a library of mutants of A. hydrophila, in order to identify new genetic determinants that could be involved in regulation mechanism of resistance to β-lactam antibiotics, and may constitute novel targets for therapeutic application. The mutants obtained were screened for either increased or decreased susceptibility to ampicillin, cefotaxime and imipenem. The susceptibility profile was measured by broth dilution. Since it has been shown that cells in biofilms are generally more resistant to antimicrobial chemotherapies than planktonic cells, the mutants were also evaluated for their ability to form biofilms in a microtitre plate assay using crystal violet staining. This approach allowed the identification of 17 mutants presenting altered resistance phenotypes: 5 mutants revealed to increase the susceptibility to imipenem, 11 showed reduction of the susceptibility to cefotaxime and 1 mutant, when compared with the parental lineage, showed an increase of susceptibility to imipenem and a decrease of susceptibility to cefotaxime. Futhermore, all the 17 mutants also presented reproducible alterations in their capability of biofilm formation. By sequencing the transposon flanking region of 4 mutants, the following genes encoding proteins involved in the resistance to β-lactams were identified: a transcriptional regulatory protein, an ATPase, a GDP-mannose 4,6-dehydratase and a hypothetical protein with unknown function.