Combined use of chemical data and biomarkers in aquatic key spicies : an ecotoxicological study in Óbidos lagoon

Abstract

As lagoas costeiras têm sido sujeitas a fortes pressões antrópicas capazes de causarem stresse nos organismos residentes. Neste contexto, o presente trabalho constitui um estudo de biomonitorização investigativa na Lagoa de Óbidos (Portugal) dado que este sistema representa um paradigma de lagoa costeira com sintomas de eutrofização e de contaminação moderada por metais. Foi adoptada uma abordagem ampla que combinou a avaliação dos níveis de exposição externa com marcadores de bioacumulação e efeitos bioquímicos em três espécies-alvo – Ulva sp. (alface do mar), Carcinus maenas (caranguejo verde) e Liza aurata (taínha-garrento). Foi investigado em que medida estas espécies-alvo reflectem a contaminação ambiental, tendo sido consideradas três áreas de amostragem: braço da Barrosa e braço do Bom-Sucesso, ambos localizados em áreas confinadas na porção superior da Lagoa, e ainda uma área seleccionada como referência, situada mais próximo da embocadura, na porção central/inferior da Lagoa. Foram quantificados, sazonalmente e numa escala dia-noite, parâmetros de qualidade da água, nomeadamente oxigénio dissolvido, nutrientes e metais na coluna de água. Determinaram-se igualmente as concentrações de metais nos sedimentos superficiais das referidas áreas da Lagoa. As espécies-alvo foram amostradas sazonalmente (Ulva sp., C. maenas) ou, no mínimo, no Inverno e Verão (L. aurata) de forma obter a uma representatividade de períodos de condições ambientais contrastantes, em particular no que concerne às fontes de metais e à disponibilidade de nutrientes. Foram medidos os níveis de peroxidação lipídica (LPO) e respostas antioxidantes (catalase – CAT, glutationa peroxidase – GPx, glutationa reductase – GR, glutationa-S-transferase – GST, glutationa total – GSHt) em Ulva sp., hepatopancreas de caranguejo, e órgãos-chave (brânquias, fígado e rim) de taínha. A capacidade de biotransformação - actividade da etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) - foi igualmente avaliada em hepatopancreas de C. maenas. As concentrações de metais (Mn, Cu, Ni, Cr, Pb e Cd) foram determinadas em Ulva sp., C. maenas e L. aurata e investigadas as associações entre a respectiva acumulação e os efeitos bioquímicos. Os dados de respostas bioquímicas de Ulva sp., C. maenas e L. aurata foram integrados de forma a calcular um índice geral de stresse (“Integrated Biomarker Response” – IBR). Os resultados em termos de níveis de metais nos sedimentos indicaram uma contaminação moderada da Lagoa. Para além disso, foram registadas apenas pequenas diferenças entre ambos os braços e o corpo central da Lagoa, enquanto diferenças mais acentuadas foram detectadas entre os braços e a Lagoa inferior. Todavia, registaram-se aumentos de metais na coluna de água do braço da Barrosa em períodos húmidos devido às entradas de água doce. Por outro lado, os níveis de metais aumentaram na coluna de água do braço da Barrosa durante a noite, apontando para a importância crucial dos processos de remobilização na disponibilidade de metais em períodos estivais. Estes processos foram considerados particularmente relevantes no braço da Barrosa dado que esta zona foi classificada neste estudo como eutrófica. De facto, esta área confinada apresentou os níveis mais elevados de nutrientes (amónia, nitrato+nitrito, fosfato), em especial no Inverno. Por conseguinte, os organismos aquáticos residentes no braço da Barrosa estarão expostos a metais no Inverno e Verão, provenientes de entradas de água doce e da remobilização do sedimento, respectivamente. De um modo geral, a Ulva sp. (Outono, Primavera, Verão) apresentou concentrações de metais mais elevadas no braço da Barrosa, tal como as brânquias e fígado de L. aurata (Inverno). As diferenças espaciais de metais acumulados no rim de L. aurata (Inverno e Verão) e hepatopancreas de C. maenas (Outono, Inverno e Verão) foram menos evidentes. As correlações de Pearson entre metais acumulados e os níveis na água foram investigadas nas três espécies, sendo significativas apenas para Ulva sp. Porém, as brânquias e o fígado da L. aurata apresentaram aumentos de metais no braço da Barrosa no Inverno, em concordância com a maior disponibilidade ambiental. Os metais acumulados nas três espécies-alvo variaram entre o Inverno e o Verão. No braço da Barrosa, apenas os níveis de Mn em Ulva sp. registaram máximos no Verão em comparação com o Inverno, eventualmente em resultado de uma maior incorporação durante a noite devido à remobilização de Mn do sedimento. Contrariamente à macroalga, os metais nos caranguejos e peixes aumentaram no Inverno (comparativamente com o Verão) e, portanto, a fonte externa de metais (água doce) sobrepôs-se à sua libertação intermitente durante as noites de Verão. O braço da Barrosa revelou a presença de compostos que estimularam a produção de H2O2, expressa nos aumentos de CAT e GPx em Ulva sp. (Outono e Verão), no hepatopancreas de C. maenas (Outono) e nas brânquias, no fígado e no rim de L. aurata (principalmente no Verão). Para além disso, a exposição a compostos pró-oxidantes no braço da Barrosa provocou um aumento de GST na Ulva sp. (Outono), nos caranguejos (Outono e Verão) e no rim dos peixes (Inverno). Ademais, a GSHt diminuiu nos animais (hepatopancreas de caranguejos no Verão e fígado de peixes no Inverno), tendo aumentado pontualmente em Ulva sp. (Outono). As espécies-alvo mostraram incapacidade para combater eficazmente as espécies reactivas de oxigénio (ROS) produzidas ao nível celular, tendo-se observado aumento de LPO em Ulva sp. (Outono e Primavera), C. maenas (Outono), bem como em brânquias e fígado de L. aurata (Inverno). Os resultados de LPO enfatizaram a degradação ambiental do braço da Barrosa relativamente a outras áreas da Lagoa. A comparação sazonal das respostas bioquímicas nas três espéciesalvo revelou que apenas os caranguejos e peixes apresentaram diferenças entre o Inverno e Verão ao nível das respostas de stresse oxidativo. Os resultados de IBR corroboraram a indicação de que o braço da Barrosa é a área mais deteriorada da Lagoa. Com base na análise de Pearson, a actividade de GPx na Ulva sp, bem como nas brânquias e no rim de L. aurata, foi correlacionada com os níveis de metais acumulados (Mn, Zn e Cu, respectivamente). Por outro lado, foram identificadas correlações significativas entre GST em Ulva sp. e o Cd acumulado. De igual modo, a GST nas brânquias, no fígado e no rim de L. aurata foi correlacionada com os níveis acumulados de Cu, Pb e Cu, respectivamente. Apesar das correlações encontradas, outros factores relacionados com o processo de eutrofização foram putativamente associados aos efeitos bioquímicos registados no braço da Barrosa. Por exemplo, neste trabalho sugeriu-se que a grande flutuação do oxigénio dissolvido registada no Verão induz a activação de defesas antioxidantes nas brânquias das taínhas. Por outro lado, no Inverno, as elevadas concentrações de amónia e nitrito estarão eventualmente associadas às respostas bioquímicas nas macroalgas, caranguejos e peixes. O presente trabalho contribuiu com novas perspectivas para a biomonitorização, através da identificação de espécies e órgãos sensíveis. De facto, a Ulva sp., que tem sido pouco empregue como sentinela, demonstrou capacidade de traduzir os níveis de metais na água da Lagoa de Óbidos através dos níveis acumulados. Por outro lado, a sua capacidade de resposta em termos de parâmetros de stresse oxidativo foi comparável à dos caranguejos e dos peixes. Adicionalmente, os níveis de metais e efeitos bioquímicos nas brânquias de peixes reflectiram a condição ambiental da Lagoa de Óbidos, tendo-se este órgão de interface revelado uma importante via de absorção de metais. Com base nestas evidências, as brânquias de L. aurata foram consideradas uma “porta espelhada” no contexto da contaminação aquática. Os resultados desta tese também recomendam a separação de géneros em programas de monitorização com C. maenas. Padrões espaciais e temporais comuns às diferentes espécies-alvo foram difíceis de identificar e os biomarcadores (acumulação e efeitos bioquímicos) nas taínhas mostraram padrões específicos para cada órgão. Porém, através da análise combinada de níveis de exposição, concentrações acumuladas e respostas bioquímicas foi possível confirmar a existência de condições de risco no braço da Barrosa. De facto, a contaminação da Lagoa de Óbidos, ainda que em concentrações sub-letais, induziu alterações ao nível bioquímico nas espécies-alvo estudadas. Por conseguinte, a estratégia adoptada demonstrou a sua fiabilidade na avaliação do estado de saúde ambiental. Tendo isto em consideração, este estudo constituiu uma contribuição para a avaliação ambiental da Lagoa de Óbidos, fornecendo informação base às entidades de gestão locais. Adicionalmente, as conclusões desta tese poderão ser particularmente úteis para futuros programas de monitorização investigativa em lagoas costeiras, à escala mundial, afectadas por processos de eutrofização e contaminação moderada por metais.

Costal lagoons are still under a major human pressure that can cause stress on inhabitant organisms. An investigative biomonitoring study was carried out in the Óbidos lagoon (Portugal) since this system represents a prototype of coastal lagoon with eutrophication symptoms and moderate contamination by metals. A comprehensive approach was adopted combining the evaluation of external levels of exposure with bioaccumulation markers and biochemical effects in three target species - Ulva sp. (sea lettuce), Carcinus maenas (shore crab) and Liza aurata (golden grey mullet). It was searched in what extent these target species reflected environmental contamination. For those proposes three sites were considered: Barrosa branch and Bom-Sucesso branch located in confined areas of the upper lagoon; and middle/lower lagoon closer to the lagoon inlet and thus selected as reference area. Water quality parameters, including dissolved oxygen, nutrients and metals were surveyed in the water column over a day-night scale and on a seasonal basis. Surface sediments were analyzed to assess the pool of metals in several areas of the lagoon. Target species were collected seasonally (Ulva sp., C. maenas) or at least in winter and summer (L. aurata) in order to cover periods of contrasting environmental conditions regarding metal sources and nutrients availability. Lipid peroxidation (LPO) and antioxidant responses (catalase - CAT, glutathione peroxidase - GPx, glutathione reductase - GR, glutathione-Stransferase – GST, total glutathione - GSHt) were measured in Ulva sp., crabs’ hepatopancreas and key organs (gills, liver and kidney) of mullets. Additionally, hepatopancreas of C. maenas were analyzed for biotransformation capacity (ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity). Levels of metals (Mn, Cu, Ni, Cr, Pb and Cd) were measured in Ulva sp., C. maenas and L. aurata and associations between metals accumulation and biochemical effects were searched. A general stress index (Integrated Biomarker Response – IBR) was applied to data on biochemical responses of Ulva sp., C. maenas and L. aurata. Metal levels in surface sediments pointed to a moderate contamination of the lagoon. Moreover, only slightly differences were recorded among both branches and the middle lagoon, whereas spatial differences were more accentuated between both branches and the lower lagoon. Despite that, metals in the water column enhanced at Barrosa in wet period due to freshwater inputs. Additionally, metal concentrations increased in the water column at Barroasa branch during the night, pointing to the main importance of remobilization processes for metals availability in warm conditions. This was considered particularly relevant at Barrosa branch since in the current study this area was classified as eutrophic. In fact, this confined area registered the highest concentrations of nutrients (ammonium, nitrate+nitrate, phosphate) particularly in winter. Accordingly, aquatic organisms living at Barrosa branch seemed to be exposed to metals both in winter and summer that would be eventually provided respectively by freshwater inputs and sediment remobilization. In general, Ulva sp. (autumn, spring and summer) presented higher metal levels at Barrosa branch, as well as gills and liver of L. aurata (winter). Spatial differences concerning accumulated metals were less pronounced for kidney of L. aurata (winter and summer) and hepatopancreas of C. maenas (autumn, winter and summer). Pearson correlations between accumulated metals and water levels were searched for the three species but only found for Ulva sp. Despite that, gills and liver of L. aurata exhibited increases of metals at Barrosa branch in winter in line with the higher environmental availability. Accumulated metals in the three target species varied between winter and summer. At Barrosa, only Mn levels in Ulva sp. peaked in summer in comparison to winter, eventually related with an enhanced incorporation during the night due to the remobilization of that element from the sediment. Differently from macroalgae, metal levels in crabs and fish increased in winter (in comparison with summer) and thus, external metal levels (freshwater inputs) superimposed intermittent release of summer nights. Barrosa branch also presented compounds that stimulated the production of H2O2 as depicted by the increase of CAT and GPx in Ulva sp. (autumn and spring), hepatopancreas of C. maenas (autumn), as well as gills, liver and kidney of L. aurata (mainly in summer). Moreover, the exposure to pro-oxidant stressors at Barrosa branch led to an elevation of GST in Ulva sp. (autumn), crabs (autumn and summer) and fish’ kidney (winter). Additionally, GSHt decreased in animals (crabs’ hepatopancreas in summer and fish’ liver in winter), whereas a punctual increase was recorded in Ulva sp. (autumn). Target species did not cope efficiently with reactive oxygen species and LPO was recorded for Ulva sp. (autumn and spring), C. maenas (autumn) and L. aurata gills and liver (winter). Results on LPO highlight the environment state degradation at Barrosa branch relatively to other areas of the lagoon. The seasonal comparison of biochemical responses in the three target species revealed that only crabs and fish exhibited differences between winter and summer on oxidative stress responses. Current IBR results substantiated the evidence that Barrosa branch is the most impacted site in the lagoon. Based on Pearson analysis, GPx activities in Ulva sp., as well as in gills and kidney of L. aurata were correlated with accumulated metal levels (Mn, Zn and Cu, respectively). Moreover, significant correlations were obtained between GST in Ulva sp. and accumulated Cd. Similarly, GST in gills, liver and kidney of L. aurata were correlated respectively with accumulated Cu, Pb and Cu. Despite the obtained correlations, other factors related with eutrophication process were hypothesised to be on the basis of biochemical effects at Barrosa. For instance, the broad fluctuation of dissolved oxygen recorded in summer was suggested to lead to the activation of antioxidant defences in mullet’s gills. Additionally, in winter the higher levels of ammonium and nitrite were eventually associated with biochemical responses in macroalgae, crabs and fish. The work brought new perspectives to biomonitoring by the identification of sensitive species and organs. In fact, Ulva sp., that had been underemployed as sentinel, displayed the ability to closely reflect the metal levels in water of the Óbidos lagoon on its body burden. Additionally, the responsiveness of oxidative stress parameters in Ulva sp. was comparable to that of crabs and fish. Furthermore, metal levels and biochemical effects in fish gills reflected the environmental status of the Óbidos lagoon, showing this interface organ as an important route of entry for metals. Based on both evidences, L. aurata gills were considered as a “mirror door” in the context of water contamination assessment. Moreover, data of this thesis recommend genders separation in biomonitoring programs using C. maenas. Additionally, common spatial and temporal patterns to the different target species were difficult to discern and biomarkers (accumulation and biochemical effects) showed to be organspecific in mullets. Despite that, through a combined analysis of external levels of exposure, accumulation levels and biochemical responses it was possible to confirm the existence of hazardous conditions at Barrosa branch. In fact, the presence of contamination at the Óbidos lagoon, even at sublethal concentrations, induced changes at biochemical levels in the target species. Hence, the adopted strategy had demonstrated its suitability for environmental health assessment. In view of that, this study is a contribution for Óbidos lagoon health assessment and offered the baseline information for local management entities. Moreover, conclusions of the thesis may be particularly useful for designing future investigative monitoring programs in coastal lagoons worldwide suffering from eutrophication and moderate contamination by metals.