Estudo molecular da resistência antifúngica de Candida parapsilosis

Abstract

A incidência de infeções fúngicas invasivas por Candida parapsilosis tem vindo a aumentar ao longo da última década. O maior grupo de risco por este tipo de infeção são indivíduos imunodeprimidos, principalmente neonatos de baixo peso, sendo esta levedura transmitida por via horizontal principalmente através do contato com as mãos dos prestadores de cuidados de saúde. Para o tratamento destas infeções estão disponíveis 4 classes de agentes antimicóticos, mas destes os mais utilizados são os azóis. Os agentes azólicos têm como alvo a via biossintética do ergosterol, principal constituinte da membrana celular fúngica, através da inibição direta da enzima lanosterol 14α-demetilase. Um estudo recente demonstrou que as estirpes resistentes obtidas após exposição de uma estirpe clínica suscetível de C. parapsilosis BC014 aos antifúngicos azólicos, fluconazol e voriconazol, aumentaram a expressão de transportadores membranares de efluxo MDR1, assim como o fator de transcrição Mrr1 que controla a sua expressão. Após sequenciação do gene MRR1 das estirpes resistentes BC014RFLC e BC014RVRC foram encontradas mutações sense-to-sense G583R e K873N, respetivamente. Encontra-se descrito para C. albicans que a sobre-expressão do MRR1 e do MDR1 está relacionada com mutações gain-of-function neste fator de transcrição. De forma a investigar a importância das mutações pontuais no fator de transcrição Mrr1, identificadas nas estirpes resistentes, pretendia-se efetuar a deleção do gene MRR1 na estirpe clínica suscetível BC014 e seguidamente à sua complementação independente com os genes mutados. Para tal foi utilizada a ferramenta molecular SAT1-Flipper. No entanto, perante a impossibilidade da obtenção de clones Δmrr1/Δmrr1, o trabalho prosseguiu com a complementação de uma estirpe de C. parapsilosis Δmrr1/Δmrr1, denominada Δ1. A integração dos genes MRR1 mutados, MRR1_RFLC e MRR1_RVRC, não alterou a suscetibilidade aos azóis das estirpes complementadas. Os valores de CIM obtidos foram de 1 μg ml-1 ao fluconazol e 0.03 μg ml-1 ao voriconazol, apresentando fenótipo suscetível. Estes resultados demonstram que as mutações pontuais no gene MRR1 não são gain-of-function, não estando por isso associadas à resistência ao fluconazol e voriconazol em C. parapsilosis.

For the past decade the incidence of invasive fungal infections with C. parapsilosis has been dramatically increased. Infections with this opportunistic pathogenic yeast are most common in immunocompromised patients like neonates low-birth-weight and is frequently transmitted horizontally through the hands of health care workers. For the treatment of this infections are available four antimycotic classes, being azoles the most commonly used. These azolic agents target the sterol biosynthetic pathway, the major sterol in the fungal cell membrane, by inhibiting the enzyme sterol 14α-demethylase. A recent study has shown that the resistant strains BC014RFLC and BC014RVRC, obtained after exposure of a susceptible clinical strain C. parapsilosis BC014 to fluconazole and voriconazole, displayed increased expression of the MDR1 multidrug resistance and its transcription factor Mrr1. The sequencing of the gene MRR1 in these resistant strains identified two sense-to-sense mutations G583R (BC014RFLC) and K873N (BC014RVRC). In C. albicans the overexpression of MRR1 and MDR1 is associated with gain-of-function mutations in the transcription factor. In the present study we investigate the importance of Mrr1 point mutations detected in C. parapsilosis BC014RFLC and BC014RVRC in their azole resistance. For that we intended to knockout the MRR1 gene in the susceptible parental strain BCO14 and then separately complementate the Δmrr1/Δmrr1 strain with the mutated genes, MRR1_RFLC and MRR1_RVRC. For that, it was used the SAT1-flipper cassette. In the absence of null mutants (Δmrr1/Δmrr1) achievement, it was decided to complement an Δmrr1/Δmrr1 strain designated Δ1. The independent integration of the MRR1_RFLC and MRR1_RVRC genes in the strain Δ1 did not alter the susceptibility profile to fluconazole and voriconazole. The MIC values determined for parental and complemented strains were identical, 1 μg ml-1 to fluconazole and 0.03 μg ml-1 to voriconazole, displaying a susceptible phenotype. Therefore, these preliminary results demonstrated that mutations found in MRR1 transcription factor were not associated with fluconazole and voriconazole resistance in C. parapsilosis.