Cultura in vitro do Ulmeiro : (Ulmus minor Mill.)

Abstract

O ulmeiro que predomina em Portugal (Ulmus minor Mill.), é uma árvore de extrema importância como ornamental e como fornecedora de madeira de excelente qualidade. Infelizmente, desde o início do século passado, a grafiose dos ulmeiros ou DED (“Dutch Elm Disease”) está a provocar uma devastadora mortandade tendo o número de ulmeiros diminuído drasticamente por todo o Hemisfério Norte. Esta catástrofe desencadeou uma intensa pesquisa que incidiu na obtenção de híbridos tolerantes à doença e no controlo desta. Os resultados obtidos não recompensaram o investimento realizado. A conservação e a melhoria dos ulmeiros continua assim a ser uma prioridade dada a perda de variabilidade genética que surge como consequência do seu desaparecimento. A cultura in vitro é uma área que permite a concretização destes objectivos, uma vez que possibilita a multiplicação e conservação de genótipos importantes mas também a sua melhoria através, por exemplo, da fusão de protoplastos. Actualmente, defende-se ainda que o estabelecimento de um sistema eficiente de regeneração de plantas é indispensável na recuperação de clones/indivíduos conservados pelo frio, dado que a preservação de colecções de ulmeiros em campo é muito dispendiosa. Protocolos de introdução in vitro foram já desenvolvidos para algumas espécies de Ulmus. No entanto, o ulmeiro exibe uma grande variedade de respostas no que respeita ao seu cultivo in vitro pelo que, para um determinado genótipo, é frequente ser necessário desenvolver um particular sistema de cultura. Por todas estas razões, o estudo sobre a cultura in vitro do ulmeiro existente em Portugal era importante e inadiável. A cultura in vitro de U. minor foi iniciada com o estabelecimento de um protocolo de proliferação de rebentos, a partir de várias árvores, utilizando um meio com a constituição base de DKW. Após uma fase de enraizamento in vitro ou em solo, as plantas aclimatizadas foram transferidas para o campo. Foram também obtidas plantas por produção adventícia de rebentos em calo e folhas. Na presença de 1 mg/l de BAP foram obtidos rebentos via organogénese indirecta em calo e, nas folhas, foram obtidos rebentos por via directa e indirecta. Numa segunda fase, foram isolados protoplastos a partir de folhas e de calo, usando uma série de combinações de enzimas hidrolíticas. Os protoplastos de folha in vitro foram cultivados usando vários métodos, tendo o método de cultura em gotas de agarose promovido a formação de colónias e de microcalos. Pela primeira vez, o meio KM foi usado com sucesso no cultivo de protoplastos de folha de ulmeiro. Finalmente, foram ensaiados protocolos para o estabelecimento de culturas embriogénicas. Sendo a embriogénese somática uma das vias mais lucrativas de regeneração de plantas, esta enquadra-se na estratégia actual adoptada para o ulmeiro como uma inegável mais valia. Uma vez que este tipo de cultura ainda não tinha sido estabelecido a partir de material adulto do género Ulmus, o seu estudo era fundamental e foi abordado com especial interesse e detalhe. O protocolo que se mostrou mais eficiente foi aquele que envolveu o uso de folhas jovens in vitro que foram colocadas em meio MS com 2,4-D e cinetina, no escuro, durante oito semanas. Nestas condições obteve-se um calo embriogénico a partir do qual se formaram as estruturas embriogénicas. Os protocolos de cultura in vitro do ulmeiro, estabelecidos nesta tese, fornecem assim uma imprescindível base de trabalho em futuros programas de conservação e melhoramento da população Portuguesa de ulmeiros.

The elm tree that predominates in Portugal (Ulmus minor Miill.) is important both as ornamental and as a timber supplier of excellent quality. Unfortunately, DED (Dutch Elm Disease) has been the cause of a catastrophic drop in the number of elms in all the Northern Hemisphere, since the beginning of the 20th century. This catastrophe has lead an intense research about, in one way, the control of the disease and in another way in the production of tolerant hybrids. Despite this intense research, the results do not reward the performed investment. The goals of elm preservation and improvement remains regarding the genetic losses due to elm disappearance. In vitro culture is an area that allows the concretization of these goals since it permits the multiplication and preservation of important genotypes and also their improvement by, for example, protoplast fusion. Actually, the establishment of an efficient system of plant regeneration is also defended as indispensable in the recuperation of clones/genotypes criopreserved, since the maintenance of elm collections in the field is very expensive. Micropropagation protocols had already been developed for some species of Ulmus. However, there is a great genotypic variety concerning elm’s in vitro culture and often, for one determined genotype, it is necessary to develop a particular system of culture. For these reasons, the study of in vitro culture of the elm from Portugal was very important and undelayable. Ulmus minor in vitro culture was initiated by the establishment of a protocol for proliferation of shoots, from various trees, using a medium with the basal constitution of DKW. After a rooting stage in vitro or in soil, the acclimatized plants were transferred to the field. Plants were also produced by adventitious regeneration of shoots in callus and leaves. In the presence of 1 mg/l of BAP shoots were produced through indirect organogenesis in callus and, in leaves, shoots were produced via direct and indirect organogenesis. In a second phase, protoplasts were isolated from leaves and callus using a series of hydrolytic enzymes combinations. In vitro leaf protoplasts were cultivated following some methods of culture, and the method of culture in agarose droplets promoted the production of colonies and microcalli. For the first time, KM medium was used with success in the culture of elm leaf protoplasts. Finally, protocols for the establishment of embryogenic cultures had been experimented. Since somatic embryogenesis is one of the most advantageous ways of plant regeneration, it fits in the current elm’s strategy as an undeniable value. Until now, this type of culture had not been developed from adult material of any species of the Ulmus genus. Because of this, its study was indispensable and was boarded with special interest and detail. The protocol that showed most efficient involved the use of young in vitro leaves that were placed in MS medium with 2,4-D and kinetin, in the dark, during eight weeks. In these conditions, an embryogenic callus was formed and from this callus embryogenic structures were produced. The elm in vitro culture protocols, established in this thesis, provides an essential work base in future preservation and improvement programs of Portugal elm population.