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 Estados conformacionais da cardosina A
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/927

title: Estados conformacionais da cardosina A
authors: Oliveira, Cláudia Sofia Soares de
advisors: Barros, Marlene Maria Tourais de
Fonseca, Henrique Manuel Apolónia Coutinho
keywords: Biologia
Cardosinas
Proteases aspárticas
Enzimas
Concentração de iões de hidrogénio
issue date: 2007
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: As proteinases aspárticas (PAs) são um importante grupo de enzimas devido ao envolvimento em processos patológicos e fisiológicos. Apesar da diversidade funcional apresentam homologia nos seus domínios N- e Cterminal. Esta estrutura parece ter evoluído através de processos de duplicação e fusão interna de genes. Entre os membros das PAs está a cardosina A de Cynara cardunculus sp, uma enzima heterodimérica que tem sido alvo de intensa caracterização. O seu processo de purificação permite grandes rendimentos de enzima pura, tornando-se um candidato atractivo para proteína modelo em estudos de estrutura/função. Nos últimos anos alguns estudos de estrutura de proteínas têm sido feitos sobre os estados desnaturados e não nativos de proteínas. O objectivo destes estudos é a investigação do desenrolamento de proteínas e das possíveis funções fisiológicas destes estados não nativos. As PAs são enzimas derivadas de zimogéneos, que normalmente desenrolam irreversivelmente e cujos estados parcialmente desnaturados são estabilizados. No entanto, ainda há pouca informação sobre os estados não nativos. A caracterização estrutural destas proteínas poderá esclarecer as propriedades funcionais das PAs, bem como a estrutura, o enrolamento e a actividade das proteínas em geral. Neste trabalho os efeitos do pH e do acetonitrilo foram estudados para obter informação acerca dos estados conformacionais da cardosina A. Os estados conformacionais induzidos pelo pH e pelo acetonitrilo mostraram ser diferentes. A desnaturação térmica da cardosina A mostrou tratar-se de uma proteína estável provavelmente devido às fortes interacções entre subunidades que vão enfraquecendo à medida que o valor de pH varia. A desnaturação da cardosina A mostrou ocorrer através do desenrolamento independente das suas cadeias polipeptídicas, onde a cadeia polipéptidica de baixo peso é menos estável do que a de alto peso. Adicionalmente, a desnaturação alcalina da cardosina A resulta na dissociação do heterodímero. Por outro lado, baixas concentrações de acetonitrilo induziram um aumento da actividade da cardosina A relacionada com ligeiro aumento da estrutura secundária. No geral, o acetonitrilo induz alterações de estrutura secundária e terciária na cardosina A inactivando-a a concentrações mais elevadas, mas baixas concentrações do solvente parecem resultar num efeito directo no local activo. Finalmente, as alterações dependentes do tempo em 10 % acetonitrilo mostraram que a cardosina A adopta uma conformação onde o desenrolamento da cadeia de baixo peso é notório. Neste estado a cardosina A apresenta uma actividade catalítica comparável à do estado nativo sugerindo uma elevada flexibilidade funcional e conformacional da enzima. Os resultados foram comparados com informação estrutural e funcional de outras PAs e as possíveis implicações da natureza heterodimérica da cardosina A discutidas.

Aspartic proteinases (APs) are an important group of proteinases due to their involvement in pathological and physiological processes. Despite their function diversity they have N-terminal and C-terminal domains that show evidence of homology to each other. This structure appears to have arisen by ancient internal gene duplication and fusions. Among the most interesting members of aspartic proteinases is cardosin A from Cynara cardunculus sp, a recently well characterized heterodimeric enzyme. High yields of pure protein can be obtained making it an attractive model protein for structure/function studies. In the last years protein structural studies have been carried out on denatured and other non-native states of proteins. The aim of such studies is to investigate protein folding and to understand the physiological roles of nonnative structures. APs are zymogen-derived enzymes, which usually unfold irreversibly and become trapped in partially denatured states. There is still little information about the structures of these denatured states. Characterization of such states in APs should give insights not only into the functional properties of this very important family of enzymes, but also in protein folding and activity of proteins in general. In this work the effects of varying pH and acetonitrile concentrations on the structure and folding of cardosin A were investigated to obtain further insight of cardosin A conformational states. pH and acetonitrile induced conformational states in cardosin A revealed to be different. It is a stable protein probably due to strong intersubunit interactions that weaken as pH values varies. Furthermore, the unfolding of cardosin A occurs through independent unfolding of its polypeptide chains, where the small chain is less stable than the longer chain. The alkaline denaturation of cardosin A was shown to point to the heterodimer dissociation. At low acetonitrile concentrations cardosin A activity is increased and correlated with mild secondary structural changes. Overall, acetonitrile induce tertiary and secondary structure changes in cardosin A molecule, causing the complete inactivation at high acetonitrile concentrations and at low organic solvent content a direct effect in the active site was suggested. Finally, time dependent changes induced by 10 % acetonitrile were studied and showed that at some point cardosin A adopts a partial folded conformation with the unfolding of the small chain. This conformational state is characterized by catalytic activity comparable with the native cardosin A, pointing to high cardosin A functional conformational flexibility. Results were compared with available structure/function information of other APs and the possible physiological roles of the heterodimeric nature of cardosin A discussed.
description: Doutoramento em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/927
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