Effects of ozone in Scophthalmus maximus raised in a closed system

Abstract

O tratamento de água por ozonização tem demonstrado ser uma ferramenta útil na remoção de resíduos sólidos e estabilização da qualidade da água em sistemas de recirculação, assim como no controle de doenças, pelo que a sua relevância no contexto da piscicultura intensiva é consensualmente assumida. Contudo, as suas consequências a nível bioquímico, fisiológico e citogenético em peixes são ainda pouco conhecidas. Assim, o presente trabalho teve como objectivo investigar os efeitos da exposição a ozono em pregado (Scophthalmus maximus) através da avaliação do seu potencial genotóxico (teste de anomalias nucleares eritrociticas - ANE), de indicadores de stress (níveis plasmáticos de cortisol, glucose e lactato), de alterações nos parâmetros hematológicos (concentração de hemoglobina - Hb, contagem de eritrócitos e hemoglobina corpuscular média - HCM) e índices de condição fisiológica (factor de condição de Fulton – K, índice hepatossomático – IHS). Indivíduos com um peso médio de aproximadamente 75.0±1.41g foram submetidos a 6 horas diárias de exposição a água tratada com ozono (0.15 mg L-1) durante 3 dias consecutivos. Os peixes foram amostrados nos dias 1, 2 e 3, assim como 1 (R1) e 7 (R7) dias após o tratamento, de modo a avaliar a eventual de recuperação. Um grupo controlo foi mantido nas mesmas condições experimentais, mas sem exposição ao ozono. O teste t foi utilizado para avaliar a significância estatística das diferenças entre os grupos tratado e controlo a cada momento de amostragem. Foi detectada uma indução de ANE ao longo da exposição, indicando dano genético. Adicionalmente, este efeito clastogénico prolongou-se para além do período de exposição até ao dia R7. A concentração de glucose plasmática aumentou significativamente apenas no período pós-exposição (R1 e R7). Relativamente ao lactato plasmático, foram registados recorrentemente níveis mais baixos nos animais expostos, apesar dessa descida ter sido estatisticamente significativa apenas no primeiro dia de exposição e no dia R1. O cortisol plasmático aumentou significativamente apenas no primeiro dia de exposição, após o que se manteve inalterado até ao final da experiência. A concentração de Hb aumentou significativamente nos dias 1 e 3, assim como em R1, onde atingiu o nível máximo. Do modo semelhante, o nº de eritrócitos aumentou significativamente nos dias 2 e 3, mostrando um efeito prolongado até ao dia R1. Não se registaram alterações ao longo da experiência na HCM, assim como no factor K e IHS. Os resultados apontam claramente para uma condição de stress induzida pelo ozono, expressa num aumento inicial de cortisol plasmático e um aumento tardio da glicemia (período pós-exposição). A redução de lactato plasmático observada pode constituir um aumento compensatório do metabolismo aeróbico dos peixes expostos, o que está de acordo com o aparente aumento do transporte de oxigénio, expresso nos aumentos de Hb e nº de eritrócitos. Os custos metabólicos associados aos processos de reparação do ADN e desintoxicação do ozono e/ou seus subprodutos, assim como o desvio de energia para manutenção do metabolismo, podem ter repercussões negativas na taxa de crescimento do pregado. Globalmente, ficou demonstrado que os pregados juvenis não foram capazes de se adaptar completamente à exposição a água tratada com ozono em condições realistas, pelo que se sugere a interferência com a saúde dos peixes. Os presentes resultados contribuem para um conhecimento biológico da toxicidade do ozono e para o estabelecimento de margens de segurança na aquicultura em sistemas de recirculação. Apesar de o presente estudo ter sido desenhado para avaliar o impacto do ozono no contexto dos sistemas de recirculação em aquicultura, o risco para as populações aquáticas selvagens associado a descargas de efluentes (municipais e industriais) tratados com ozono não pode ser subestimado. Nesse sentido, assume particular importância o potencial genotóxico demonstrado, dada a relação causal já demonstrada em relação a malformações e lesões neoplásicas.

Ozonation is proven useful in recirculating systems promoting the removal of solid matter, the stabilization of water quality and disease control, being thus consensually assumed that it could find a relevant place in the intensive fish culture. Nevertheless, its biochemical, physiological and cytogenetic effects on fish are still largely unknown. Hence, this research investigated the effects of ozone exposure in turbot (Scophthalmus maximus) by assessing its genotoxic potential (erythrocytic nuclear abnormalities assay - ENA), general stress indicators (plasma cortisol, glucose and lactate), alterations on hematological parameters (hemoglobin concentration - Hb, red blood cell count - RBC, and mean cell hemoglobin - MCH) and physiological state indices (Fulton’s condition factor – K, hepatossomatic index - HSI). Turbot specimens with an average weight of approximately 75.0±1.41g were subjected to a daily 6-hr ozone (0.15 mg L-1) exposure, repeated for 3 consecutive days. In order to assess the potential recovery after ozone treatment, fish were also analyzed on 1- (R1) and 7-day (R7) post-treatment. A control group was kept under the same experimental conditions but without ozone exposure. The t-test was used to assess the statistical significance of differences between ozone-treated and control groups in each sampling moment. A significant induction on ENA frequency was recurrently detected along the exposure period, signalling genetic damage. Moreover, this clastogenic effect was prolonged beyond the exposure period up to day R7. Plasmatic concentrations of glucose increased significantly only on the post-treatment period (R1 and R7) and no statistically significance were observed during the ozone exposure. Concerning plasma lactate concentration, lower levels were regularly found in ozone treated fish in relation to the control, even though statistically significant differences were recorded only on the first day of treatment and on R1. Plasmatic levels of cortisol revealed a significant elevation on ozone group following 1 day exposure and afterwards no significant alterations were recorded up to the end of the experiment. The Hb concentration was significantly increased on days 1 and 3, as well as on day R1 where it reached the maximum level. Similarly, RBC were significantly increased on days 2 and 3, showing a prolonged effect on day R1. No significant alterations were observed along the experiment on MCH levels, as well as on K factor and HSI. The results clearly pointed out an ozone-induced stressful condition, expressed by an early plasma cortisol increase and a late hyperglycemia (posttreatment period). The lactate-lowering effect observed may constitute a compensatory increase of the aerobic capacity of fish, which is in line with the apparent improvement in oxygen transport expressed by increased Hb and RBC. The metabolic costs associated with DNA repair and detoxification of ozone and/or ozone by-products, as well as an increased expenditure of energy to sustain fish metabolism, allowing less energy for growth, can have negative repercussions on turbot growth performance. Taking into account the overall data, it was demonstrated that juvenile turbot were not able to fully adapt to ozonated water under realistic conditions (considering the tested ozone levels and the exposure duration) and thus, the interference with fish health is hypothesized. The present findings contribute to a biological based knowledge of ozone toxicity and to the establishment of safety margins in aquaculture practices adopted in recirculation systems, promoting sustainability and fish welfare. Though the present study was designed to assess the impacted of ozonated water in the context of recirculation aquaculture systems (RASs), the risk to wild aquatic populations resulting from discharges of ozone primarytreated effluents (municipal and industrial) cannot be overlooked. In this regard, the genotoxic potential demonstrated can assume particular importance due to causal linkage with malformations and neoplastic lesions.