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 The key enzyme for mannosylglyceramide synthesis in Rhodothermus marinus
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/904

title: The key enzyme for mannosylglyceramide synthesis in Rhodothermus marinus
authors: Ferreira, Ana Catarina Morouço
advisors: Correia, António Carlos Matias
Costa, Milton Simões da
keywords: Biologia
Microorganismos
Enzimas
Biossíntese
Aminoácidos
issue date: 2010
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: Na presença de elevadas concentrações de sal no meio de cultura a bactéria halotermofílica Rhodothermus marinus acumula no interior das células compostos orgânicos de baixo peso molecular designados solutos compatíveis. Nestas condições e à temperatura de 65 ºC, este organismo acumula elevados níveis de manosilgliceramida (MGA) e manosilglicerato (MG) e níveis mais baixos de trealose, glutamato e glucose. O soluto manosilgliceramida é um derivado de manosilglicerato no qual o OH do grupo carboxílico é substituído por um grupo amino. Este soluto com carga neutra foi detectado pela primeira vez por RMN na bactéria R. marinus e, até ao momento, não há registo da sua presença ou acumulação em nenhum outro microorganismo. A forma como a bactéria R. marinus gere o seu metabolismo por forma a sintetizar este soluto permanece uma incógnita. Em R. marinus, os dois genes localizados imediatamente a seguir aos dois genes envolvidos na biossíntese de MG codificam duas enzimas, uma identificada como uma “hypothetical protein” com um domínio pertencente à família Acetil transferases e a outra identificada como uma aminoácido desidrogenase. No presente trabalho estudou-se a possibilidade de a enzima aminoácido desidrogenase ser responsável pela libertação de um grupo amino a partir de um aminoácido e a possibilidade da “hypothetical protein” ser responsável pela transferência desse grupo amino para a molécula de manosilglicerato (molécula carregada negativamente) ou para o intermediário fosforilado, o manosil-3-fosfoglicerato (MPG), percursor de manosilglicerato. Realizaram-se ensaios enzimáticos usando extractos celulares de R. marinus e testaram-se diferentes substratos com o objectivo de detectar a síntese de MGA. O produto das reacções foi separado e analisado por cromatografia de camada fina (TLC). O gene que codifica a “hypothetical protein” foi clonado e expresso na estirpe E. coli BL21. Simultaneamente, estudou-se a viabilidade de a estirpe CC-16 de T. thermophilus, uma estirpe naturalmente competente, ser um hospedeiro termofílico adequado para expressão dos genes responsáveis pela síntese de MG e, desta forma perspectivar também a sua utilização como hospedeiro para a sobreprodução do soluto raro, manosilgliceramida. ABSTRACT: The halothermophilic bacterium Rhodothermus marinus has been described to accumulate intracellular solutes at high salt concentrations in the growth medium. In this condition at a temperature of 65ºC this organism accumulates high levels of mannosylglyceramide (MGA) and mannosylglycerate (MG) and low levels of trehalose, glutamate and glucose. Mannosylglyceramide, an ammonia derivative of mannosylglycerate (MG), is an uncharged compatible solute first detected by NMR and, thus far, was only found to accumulate in R. marinus. However, the orchestration of the metabolism of R. marinus for the biosynthesis of this solute remains unknown. In R. marinus, the two genes immediately downstream the genes involved in MG biosynthesis encode two enzymes, one identified as a hypothetical protein with a motif belonging to acetyl transferases family and the other identified as an amino acid dehydrogenase. We investigated the possibility of the later enzyme be the responsible for the release of an amino group from an amino acid donor and the former for the transfer of amino group for MG (negative charge molecule)r for the mannosyl-3-phosphoglycerate (MPG) the phosphorylated precursor of MG. The enzyme assays to detect the production of MGA were carried out using cell extracts of R. marinus. Products were separated and analysed by thin layer chromatography (TLC). Moreover the gene encoding the hypothetical protein was cloned and expressed in E. coli BL21. In parallel, we studied the viability of the genetic amenable T. thermophilus strain CC-16 be a suitable thermophilic host to express genes for the synthesis of MG, prospecting its utilization as a host for the overproduction of the rare solute mannosylglyceramide.
description: Mestrado em Biologia Aplicada
URI: http://hdl.handle.net/10773/904
appears in collectionsBIO - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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