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 Cationic galactoporphyrins on microorganisms photoinactivation
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/8908

title: Cationic galactoporphyrins on microorganisms photoinactivation
other titles: Galactoporfirinas catiónicas na inactivação de microrganismos
authors: Gomes, Maria Clara Ferreira de Almeida Cardia
advisors: Tomé, João Paulo Costa
Cunha, Maria Ângela Sousa Dias Alves
keywords: Microbiologia
Terapia fotodinâmica
Porfirinas
issue date: 20-Dec-2010
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is becoming a promising alternative to inactivate microbial pathogens. This therapy combines three nontoxic components, a photosensitizer (PS), light and oxygen, that when combined leads to the formation of highly cytotoxic reactive oxygen species, mainly singlet oxygen (1O2). This specie can oxidize many types of biological molecules, such as proteins, nucleic acids and lipids. The combination of positively charged groups and carbohydrate moieties with porphyrin derivatives results in an increased cell recognition and water solubility, which improves cell membrane penetration and accumulation in sub-cellular compartments. The aim of this work was to synthesize new meso-substituted glycosyl porphyrins derivatives and evaluated the efficacy of these compounds as PS in the photoinactivation of two environmental gram positive bacteria, Brevibacterium sp. and Micrococcus sp., and one gram negative bacteria, bioluminescent Escherichia coli. Brevibacterium sp. and Micrococcus sp were chosen for these studies because they were, respectively, representative of very sensitive and very resistant types to UV-B irradiation experiments. It was also evaluated the effect of 1O2 at the lipid and protein oxidation level, generated during the aPDT assay, on the two gram positive bacteria. The derivatives of meso-tetrapyridyl porphyrin were cationized by methyl iodide or by carbohydrate moieties. All synthesized compounds were characterized by proton and fluor nuclear magnetic resonance and by mass spectrometry. Two of the compounds synthesized 5,10,15,20-tetrakis(Nmethylpyridinium- 4-yl)porphyrin tetra-iodide (PS 1) and 5-[N-(Isopropylidene-6- deoxy-galactopyranos-6-yl)pyridinium-4-yl]-10,15,20-tris(N-methylpyridinium-4- yl)porphyrin tetra-iodide (PS 2) were used as PS in the aPDT assays. For the aPDT assays pure bacterial suspensions were irradiated after pre-incubation in the dark, at concentrations of 0.5, 1 and 5 μmol dm-3 of PS in the case of gram positive bacteria, and 5 μmol dm-3 in the case of gram negative bacteria. The kinetics of irradiation was evaluated by the quantification of colony forming units in aliquots collected during 15 minutes of irradiation, under 150 mW cm-2. Light and dark controls were included in all experiments. Photophysical testes (photostability and 1O2 genereation studies) were also performed. Lipid oxidation was assessed by Tiobarbituric acid (TBA) assay and results were expressed in terms of Malondialdehyde (MDA) (nmol dm-3). Protein oxidation was evaluated by 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) assay and results were expressed in terms of Protein carbonyl concentration (nmol cm-3). aPDT assays revealed that PS 2 was more effective (3.0 log of reduction) than the PS 1 (2.0 log) with 5 μmol dm-3 against E. coli. In the case of gram positive bacteria, both PS showed the same photoinactivation effect, presenting complete inactivation after 2 minutes of irradiation. However, with lower concentration PS 1 showed to be more effective than PS 2 in both gram positive bacteria. Photophysical studies showed that both PS are photostable and good 1O2 producers. ! Lipid peroxidation assays displayed different results for both environmental bacteria. In Micrococcus no lipid oxidation was observed with PS 1 while with PS 2 was observed around 31% of lipid oxidation (0.083 nmol dm-3). In Brevibacterium PS 1 caused 28% (0.063 nmol dm-3) and PS 2 50% (0.093 nmol dm-3) of lipid peroxidation. According to the protein oxidation results, Micrococcus showed around 2.1 nmol mL-1 and 6.2 nmol mL-1 of protein carbonyls with PS 1 and 2, respectively. In the case of Brevibacterium 5.0 nmol mL-1 and 4.8 nmol mL-1 were observed with PS 1 and 2, respectively. Both porphyrins showed good photoinactivation results on gram negative and gram positive bacteria. Susceptibility of Brevibacterium sp. and Micrococcus sp. to aPDT were different to those showed in UV-B irradiation by these same bacteria. Lipid oxidation assays allowed to conclude that, in Brevibacterium, both PS act in plasma membrane while in Micrococcus this only happens with the PS with a carbohydrate moiety. Protein oxidation led to the conclusion that protein damage may have occurred due to lipid oxidation or direct interaction of 1O2 with proteins.

A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) está-se a tornar uma alternativa promissora para inactivar microrganismos patogénicos. Esta terapia consiste na combinação de três elementos não tóxicos, fotosensibilizadores (PS), luz e oxigénio que, quando combinados conduzem à formação de espécies reactivas de oxigénio altamente citotóxicas, nomeadamente o oxigénio singuleto. Estas espécies podem oxidar muitos tipos de moléculas biológicas, como o caso de proteínas, ácidos nucleicos e lípidos. A combinação de grupos com cargas positivas e hidratos de carbono com derivados porfirínicos resulta num aumento de reconhecimento celular e solubilidade em água, melhorando a penetração na membrana celular e acumulação em compartimentos sub-celulares. O objectivo deste trabalho foi sintetizar novos derivados porfirínicos mesoglicosil substituídos e avaliar a eficácia destes compostos como PS na fotoinactivação de duas bactérias gram positivas ambientais, Brevibacterium sp. e Micrococcus sp. e uma bactéria gram negativas, Escherichia coli bioluminescente. Brevibacterium sp. e Micrococcus sp. foram escolhidas para este estudo por serem, respectivamente, representantes de tipos muito sensíveis e resistentes a experiências de irradiação UV-B. Também foi avaliado o efeito do 1O2 a nível de oxidação de lipídios e proteínas, sobre as duas bactérias gram positivas. Os derivados porfirínicos meso-tetrapiridil foram cationizados com iodeto de metilo e unidades glicosídicas. Todos os compostos sintetizados foram caracterizados por ressonância magnética nuclear dos protões e fluor e por espectrometria de massa. Dois desses compostos sintetizados, 5,10,15,20- tetrakis(N-methilpiridinium-4-il)porfirina tetra-iodeto (PS 1) e a 5-[N- (isopropilidene-6-deoxi-galactopiranos-6-il)piridinium-4-il]-10,15,20-tris(Nmetilpiridinium- 4-il)porfirina tetra-iodeto (PS 2), foram usados como PS nos estudos de aPDT. Nos estudos de aPDT foram irradiadas, após uma préincubação no escuro, suspensões bacterianas puras com 0.5, 1 e 5 μmol dm-3 de PS no caso das bactérias gram positivas, e 5 μmol dm-3 no caso da E. coli. A cinética de irradiação foi avaliada através da quantificação de unidades formadoras de colónias (UFC) colhidas durante os 15 minutos de irradiação, sob 150 mW cm-2. Foram incluídos controlos claros e escuros em todas as experiências. Foram também realizados estudos fotofísicos (Fotoestabilidade e Geração de 1O2). A oxidação lipídica foi avaliada através do ensaio com ácido tiobarbitúrico (TBA) e os resultados expressos em termos de malondialdeído (MDA) (nmol dm-3). A oxidação de proteínas foi avaliada através do 2,4- dinitrofenilidrazina (DNPH) e os resultados expressos em termos de teor de proteína carbonilada (nmol cm-3). Os ensaios de aPDT revelaram que o PS 2 foi mais eficaz (3,0 log de recução) do que o PS 1 (2,0 log) com 5 !mol dm-3 contra E. coli. No caso das bactérias gram positivas, ambos os PS demonstraram o mesmo efeito de fotoinactivação, apresentando uma inativação completa após 2 minutos de irradiação. No entanto, nas menores concentrações o PS 1 mostrou ser mais eficaz do que o PS 2 em ambas as bactérias gram positivas. Os estudos fotofísicos demonstraram que ambos os PS são fotoestáveis e bons produtores de 1O2. Os ensaios de peroxidação lipídica apresentaram resultados diferentes para ambas as bactérias ambientais. No Micrococcus não foi observada oxidação lipídica com PS 1, enquanto com o PS 2 foi observado cerca de 31% de oxidação lipídica (0,083 nmol dm-3). No Brevibacterium o PS 1 causou 28% (0,063 nmol dm-3) e o PS 2 50% (0,093 nmol dm-3) de peroxidação lipídica. De acordo com os resultados de oxidação de proteínas, o Micrococcus apresentou cerca de 2,1 nmol mL-1 e 6,2 nmol mL- 1 de carbonilação de proteínas com o PS 1 e 2, respectivamente. No caso de Brevibacterium foram observados 5,0 nmol mL-1 e 4,8 nmol mL-1 com o PS 1 e 2, respectivamente. Ambas as porfirinas mostraram bons resultados tanto na fotoinactivação bactérias gram negativa como nas gram positivas. A suscetibilidade do Brevibacterium sp. e Micrococcus sp. na aPDT foi diferente dos resultados observados na radiação UV-B, por estas mesmas bactérias. Os ensaios de oxidação lipídica permitiu concluir que, no caso Brevibacterium ambos os PS actuam na membrana plasmática, enquanto que no Micrococcus estes danos só acontecem com o PS 2. A oxidação de proteínas levou à conclusão que os danos a nível das proteínas podem ter ocorrido devido à oxidação lipídica, ou interação directa entre o 1O2 e as proteínas.
description: Mestrado em Biologia Aplicada - Microbiologia Clínica e Ambiental
URI: http://hdl.handle.net/10773/8908
appears in collectionsBIO - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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