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http://hdl.handle.net/10773/8836
Title: | Implementação de diagnóstico molecular da doença de Danon |
Author: | Santos, Raquel Andreia Martins dos |
Advisor: | Pereira, Maria de Lourdes Gomes Santos, Maria do Rosário Neto dos |
Keywords: | Biologia molecular Doenças lisossomais de sobrecarga Diagnóstico molecular |
Defense Date: | 2010 |
Publisher: | Universidade de Aveiro |
Abstract: | As doenças lisossomais de sobrecarga (DLS) são um grupo de doenças
hereditárias do metabolismo, caracterizadas pela deficiência em determinadas
vias catabólicas intralisossomais. A doença de Danon é uma doença de
transmissão associada ao cromossoma X, clinicamente caracterizada por
cardiomiopatia, miopatia do músculo esquelético e atraso mental variável e
resulta da ocorrência de mutações no gene LAMP2 que codifica a proteína
associada a membrana do lisossoma-2 (LAMP-2). Nesta patologia, assim
como na doença de Pompe, ocorre a acumulação de vacúolos
intracitoplasmáticos com material autofágico e resíduos de glicogénio nos
músculos esqueléticos e cardíacos. Para um diagnóstico diferencial da doença
de Danon, torna-se fundamental o diagnóstico molecular. Actualmente, em
Portugal, não está implementado nenhum método molecular de diagnóstico da
doença de Danon.
0s objectivos deste estudo são implementar uma metodologia molecular para
pesquisa de alterações do gene LAMP2 por sequenciação genómica, cobrindo
as 9 regiões codificantes e as junções intrónicas flaqueadoras e, ainda,
contribuir para o diagnóstico diferencial da doença de Danon em casos de
diagnóstico complexo.
A amostra seleccionada para este estudo consistiu em 33 casos recebidos de
consultas de referência, na área das doenças neuromusculares, com suspeita
clínica de doença de Pompe, não confirmada após procedimento analítico de
diagnóstico. O uso de DBS como material biologico proporcionou grandes
vantagens em relação ao sangue total devido ao seu prático manuseamento e
transporte e envio de amostras a distância, permitindo, deste modo, reportar
esta metodologia para uma escala nacional de rastreio. Para além deste facto,
a nova metodologia torna-se num processo mais rápido e económico através
da extracção automática do gDNA no aparelho Bio Robot EZ1 e da utilização
de primers com cauda. Foram detectadas 4 alterações em 17 dos 33 casos
estudados, incluindo 3 polimoríismos do gene LAMP-2 já descritos na literatura
e 1 nova alteração intrónica, cuja natureza causal deverá ser objecto de estudo
em trabalho futuro.
O desenvolvimento deste trabalho de mestrado permitiu implementar um
método molecular de diagnóstico da doença de Danon, possibilitando o seu
diagnóstico diferencial em casos de diagnóstico complexo. A metodologia
proposta tem aplicabilidade imediata ao nível da caracterização da doença de
Danon na população portuguesa.
Finalmente, esta abordagem molecular permitirá oferecer a população
portuguesa um diagnóstico correcto e eficaz da doença de Danon e,
consequentemente, um tratamento adequado, um aconselhamento genético e
diagnóstico pré-natal as famílias afectadas. Lysosomal storage diseases (LSD) are a group of inherited metabolic diseases characterized by the impairment of the intralysosomal catabolic pathways. Danon disease is a rare X-linked disorder characterised clinically by cardiomyopathy, skeletal myopathy and variable mental retardation and results from mutations in the LAMP2 gene that encodes the lysosome-associeted membrane protein-2 (LAMP-2). In this disease, as well as in Pompe disease, occurs the accumulation of intracytoplasmic vacuoles containing autophagic material and residues of glycogen in skeletal and cardiac tissues. For a differential diagnosis of Danon disease, a molecular diagnosis is essential. Until now, in Portugal, no method has been implement for the molecular diagnosis of Danon disease. The goals of this study are to implement a molecular methodology by genomic sequencing of the LAMP2 gene, covering all 9 coding regions and flanking intron-exon junctions and alço, to contribute to the differential diagnosis of Danon disease in cases of complex diagnostic. The sample selected for this study consisted of 33 cases with compatible clinical features of Pompe disease and with as yet unconfirmed diagnosis following routine analytic procedures. The use of Dried Blood Spots as biological material provided great advantages compared to whole blood because of its convenient handling and transportation, allowing a nationwide screening. In addition, the new methodology becomes a quicker and cheaper process through the automatic extraction of gDNA by Bio Robot EZ1 and the use of primers with M13 tails. In this study, we were able to identify 4 variants in theLAMP-2 gene among the 33 studied cases, that included 3 known polymorphisms and 1 new intronic variant, which should be studied in future. This work enabled the implementation of a molecular diagnostic method for Danon disease, as well as, the differential diagnosis in cases of complex diagnosis. The proposed method is readily applicable to the characterization of Danon's disease in the portuguese population. Finally, this molecular approach will lead to accurate diagnosis of Danon's disease allowing genetic counselling and prenatal diagnosis for families affected. |
Description: | Mestrado em Biologia Celular e Molecular |
URI: | http://hdl.handle.net/10773/8836 |
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