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 Polydispersion control in enzymatic polymerization of oligonucleotides
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/7835

title: Polydispersion control in enzymatic polymerization of oligonucleotides
other titles: Controlo da polidispersividade em reacções de polimerização
authors: Cordeiro, Ana Alexandra Barrinha
advisors: Lima, João Carlos
Saraiva, Jorge
keywords: Biotecnologia
Polimerização
Cinética química
Dispersão
issue date: 2011
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: The main goal of this work is the development of a stochastic-based kinetic model to predict the polydispertion in enzymatic polymerization reactions. The fact that the polymerization occurs simultaneously in several enzymatic sites which possess different processivities results in a wide size distribution with different product sizes. To besto control the observed polydispersion, the following was considered: the enzyme selected to this study was Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) as it does not require a template sequence to catalyze DNA synthesis; and 4-methylcoumarin derivatives were the selected molecules to act as caging agents for different nucleotides making them inaccessible to the enzyme. The nucleotide is then released by light due to the break of the phosphodiester bond between the two molecules when submitted to monochromatic radiation. The referred system would bring a unique possibility of creating oligonucleotides in solution with a desired sequence. Different reaction stoichiometries were tested by the incorporation of deoxynucelotides and ribonucleotides into an oligonucleotide initiator, where distinct incorporation patterns were identified. Irradiation studies and controls for the incorporation reaction of DEACM-ATP, the cage molecule for ATP, were successfully performed. A comparison was established between the mathematic model data obtained through simulation and the experimental data related to the incorporation experiments where the polydispersion effect was observed. From this study resulted the observation of distinct incorporation velocities for each nucleotide. Several hypothesis were put together to justify why the adenine profile was so different from other nucleotides. The enzymesubstrate complex stability was considered to be one of the hypotheses. This fact can be related to the biologic function of TdT due to the presence of a “lariat-like” loop that is supposed to be related to the correct positioning of the incoming nucleotides.

O principal objectivo deste trabalho é o desenvolvimento de um modelo de cinética estocástica para prever a polidispersividade existente em reacções de polimerização enzimática. O facto de a polimerização ocorrer em paralelo em vários locais enzimáticos que apresentam diferentes processividades resulta na obtenção de uma distribuição de produtos com diversos tamanhos. Para melhor controlar esta polidispersividade foram tomadas as seguintes considerações: a enzima seleccionada para este estudo foi a Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) que catalisa a síntese de DNA na ausência de um molde; e foram utilizados derivados de 4-metilcumarinas como cages de nucleotídeos tornando-os inacessíveis à enzima. Após exposição a radiação monocromática, ocorre uma quebra de ligações fosfodiéster e o nucleotídeo é libertado. O referido sistema traria a possibilidade única de síntese de oligonucleotídeos em solução com sequência definida. Foram testadas diferentes estequiometrias de reacção, através da incorporação de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos na extremidade de um oligonucleotídeo iniciador, sendo identificados padrões de incorporação distintos para cada caso. Estudos de irradiação e controlo da reacção de incorporação com DEACM-ATP, molécula utilizada para bloquear ATP, foram efectuados com sucesso. Foi ainda estabelecida uma comparação entre os dados obtidos por modulação matemática, variando diversos parâmetros, e os vários resultados de incorporação obtidos experimentalmente onde a polidispersividade é observada. Desta, resultou a observação de diferentes velocidades de incorporação para cada nucleotídeo. Diversas hipóteses baseadas na estabilidade do complexo enzima-substrato foram propostas para justificar a observação de que o padrão de incorporação do nucleotídeo de adenina seja tão distinto dos restantes. Este facto pode estar relacionado com a função biológica da TdT devido à presença de um “lariat-like” loop que se pensa estar relacionado com o posicionamento de cada nucleotídeo.
description: Mestrado em Biotecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/7835
appears in collectionsDQ - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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