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 Characterization of PPP1 interacting proteins in male reproduction
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/7826

title: Characterization of PPP1 interacting proteins in male reproduction
other titles: Caracterização de proteínas que interagem com a PPP1 na reprodução masculina
authors: Gregório, Luís Korrodi Mineiro Marques
advisors: Fardilha, Margarida Sâncio da Cruz
Silva, Odete A. B. da Cruz e
keywords: Bioquímica
Reprodução (Biologia)
Células germinais
Espermatozóides
Proteínas: Fosforilação
Fosfatases
issue date: 13-Jan-2012
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: A fosforilação reversível de proteínas é um importante mecanismo de controlo em eucariotas. A fosfoproteína fosfatase 1 (PPP1) é uma fosfatase de serina/treonina envolvida em vários processos celulares. Existem três isoformas da subunidade catalítica (α/CA, δ/β/CB e γ/CC) com pequenas diferenças nos terminais amino e carboxílico. O gene PPP1CC sofre ainda splicing alternativo para produzir duas isoformas, a PPP1CC1 ubíqua e a PPP1CC2 enriquecida em testículo e específica de esperma. A localização e especificidade de substratos da PPP1 está dependente da formação de complexos oligoméricos com proteínas que interagem com a PPP1 (PIPs). O objetivo principal desta tese foi estudar novas PIPs, específicas de testículo e esperma, a fim de melhor caracterizar o papel desta fosfatase e dos respetivos complexos na reprodução em mamíferos. Com este fim, estudou-se a presença, localização e possíveis funções de uma PIP previamente conhecida, PPP1R2, e de duas novas PIPs, PPP1R2P3 e Tctex1d4. PPP1R2 e PPP1R2P3 estão presentes em esperma humano colocalizando com a PPP1CC2, na cabeça e na cauda. A hipótese é que as holoenzimas localizadas na cabeça terão um papel na reação acrossómica, enquanto que as holoenzimas presentes no axonema são relevantes para o controlo da motilidade flagelar. De seguida foram estudados os pseudogenes da PPP1R2, em termos de história evolutiva e de possíveis funções. Na espécie humana, a PPP1R2 tem 10 pseudogenes, 7 deles específicos de primatas. Estudos de bioinformática e dados de expressão mostram que os PPP1R2P1/P3/P9 são os pseudogenes com maior probabilidade de serem transcritos e traduzidos. Também identificámos o PPP1R2P9 em esperma humano e mostrámos que alguns pseudogenes poderão estar associados a estados fisiopatológicos. Isto indica que o processo de evolução poderá estar ligado á formação de novos genes ou ao controlo do mRNA da PPP1R2. A sobre-expressão da PPP1R2 ou PPP1R2P3 em testículo de ratinho também foi realizada, para caracterizar os mecanismos envolvidas na função dos complexos PPP1R2/PPP1R2P3-PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia dos espermatozoides. A dineína de cadeia leve, Tctex1d4, foi encontrada como interagindo com a PPP1C e como estando presente em testículo de ratinho e em esperma humano. Demonstrámos que a Tctex1d4 e a PPP1 colocalizam no centro organizador de microtúbulos e nos microtúbulos e que o motivo de ligação à PPP1 presente na Tctex1d4 parece ser importante para manter a PPP1 no centro organizador de microtúbulos e/ou para disromper ou atrasar o seu movimento ao longo dos microtúbulos emergentes. Estes resultados abrem novos caminhos para os possíveis papéis do complexo Tctex1d4-PPP1 na dinâmica dos microtúbulos, motilidade do esperma, reação acrossómica e na regulação da barreira hemato-testicular, provavelmente, através da via de sinalização do TGFß. A análise do motivo de ligação à PPP1 mostra que este é altamente conservado entre os mamíferos, com exceção das Pikas, sugerindo que esta perda aconteceu antes da radiação das Pikas, há 6-20 milhões de anos atrás. Através de um rastreio por mutações demonstrámos que a capacidade da Tctex1d4 se ligar à PPP1 é mantida nas Pikas, embora o motivo de ligação à PPP1 esteja disrompido. Este estudo abre portas para novas descobertas na área da reprodução mostrando o papel da PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia do esperma.

Reversible phosphorylation of proteins is an important intracellular control mechanism in eukaryotes. Phosphoprotein Phosphatase 1 (PPP1) is a major serine/threonine protein phosphatase involved in a wide range of cellular processes. Three closely related catalytic subunit isoforms (/CA, δ//CB and /CC) exist with only minor differences at their N- and C-terminus. PPP1CC gene can also undergo tissue-specific processing to yield a ubiquitously expressed PPP1CC1 and the testis-enriched and sperm-specific PPP1CC2 isoforms. PPP1C exists in the cell as an oligomeric complex binding to a spectrum of PPP1 interacting proteins (PIPs), which modulate both its intracellular localization and substrate specificity. The main goal of this thesis was to study novel PIPs in testis and sperm, in order to further characterize the role of PPP1CC2 and the respective complexes in mammalian reproduction. To this end we addressed the presence, localization and putative roles of a previously known PIP, PPP1R2, in testis and sperm, and two novel PPP1CC2 testis/sperm specific PIPs, PPP1R2P3 and Tctex1d4. PPP1R2/PPP1R2P3 were shown to be present in human sperm co-localizing with PPP1CC2, in the head and tail. It was shown that PPP1R2P3 is a heat stable inhibitor of PPP1CC that cannot be phosphorylated by GSK3. We hypothesize that the holoenzymes localized in the head may have a role in the acrosome reaction while the axoneme bound holoenzymes are relevant for the control of flagellar motility. To further address the PPP1R2 significance, its pseudogenes were described in terms of evolutionary history and putative functions. In human specie, PPP1R2 has ten pseudogenes most of them primate-specific. Besides PPP1R2P3, bioinformatic studies and expression data show that PPP1R2P1, PPP1R2P2 and PPP1R2P9 are the pseudogenes with more probability of being transcribed and eventually translated. Moreover, we identified PPP1R2P9 in human sperm and showed that several pseudogenes appear to be associated with physiological and pathological states. This indicates that evolution processes might be in part related with the formation of new genes or in the control of the parental PPP1R2 message. Overexpression of human PPP1R2 or PPP1R2P3 in mouse testis was also pursued to provide the molecular tools to initiate the characterization of the mechanisms behind PPP1R2/PPP1CC2 and PPP1R2P3/PPP1CC2 role in spermatogenesis and sperm physiology. Dynein light chain, Tctex1d4, was found to bind to PPP1C and to be present in mouse testis and human sperm. Tctex1d4-PPP1CC complex was shown to co-localize in the microtubule organizing centre and in microtubules. Moreover, the Tctex1d4 PPP1 binding motif seems to be important to retain PPP1CC in the microtubule organizing centre, and also to disrupt or delay its movement along microtubules. These results open new avenues to the possible roles of Tctex1d4-PPP1 complex in microtubule dynamics, sperm motility, acrosome reaction and in regulation of the blood testis barrier possibly via TGFß signaling. Moreover, PPP1 binding motif is highly conserved among mammals, except in Pikas, suggesting that this event happened before the Pikas radiation, 6-20 Million years ago. Mutational screening shows that the ability of Tctex1d4 to bind to PPP1 is maintained in Pikas, although the PPP1 binding motif is disrupted. This work opens doors to new discoveries in male reproduction and unravels the roles of PPP1CC2 and its PIPs in spermatogenesis and sperm physiology.
description: Doutoramento em Bioquímica
URI: http://hdl.handle.net/10773/7826
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