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 Insights into the molecular basis of PRRXL1 function
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/7703

title: Insights into the molecular basis of PRRXL1 function
other titles: Contributos para o estudo da base molecular da função do PRRXL1
authors: Monteiro, César Bruno da Cunha
advisors: Monteiro, Filipe Almeida
Fardilha, Margarida Sâncio da Cruz
keywords: Biologia molecular
Neurobiologia molecular
Estimulação da percepção
Neurónios
Sinapses
issue date: 24-Aug-2011
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: Correct perception of sensory stimuli by the brain involves different types of sensory neurons which require specific and functional networks. How do they differentiate into their specific subtypes, and how do they establish functional synapses, are questions that remain largely unsolved. Throughout the nervous system development, homeodomain transcription factors play a pivotal role in the control of proliferation, specificity, differentiation and establishing connectivity between neurons. Among the transcriptions factors involved in the differentiation of sensory neurons, Prrxl1 (paired related homeobox proteinlike 1) had received a special interest in our laboratory since it is involved specifically in the differentiation of nociceptive neurons within dorsal root ganglia (DRG) and their central targets within dorsal spinal cord. Prrxl1 is one of the few transcriptions factors that exhibit an expression in the primary afferent neurons and their central targets. This expression pattern suggests that Prrxl1 have an important role establishing connectivity between first order neurons and second order neurons. Indeed, analysis of Prrxl1-/- mice phenotype revealed that Prrxl1 is involved in several aspects of neuronal differentiation such as migration, axon guidance and the proper nociceptive behavior in adult individuals. Hence, Prrxl1 function might be based in the activation of a complex genetic program. Our recent findings had shown that Prrxl1 gene origin two transcripts, Prrxl1a and Prrxl1b, through the alternative splicing mechanism. Furthermore, Prrxl1a present several phosphorylation states which pattern throughout the development is variable. Hence, phosphorylation appear to have a regulatory role in Prrxl1 activity, however, kinases and phosphatases involved in this process, as well as other proteins that might interact with Prrxl1a/b remain unknown. The first objective of the present study was to characterize Prrxl1 interactome by the Yeast-Two-Hybrid system. However, it was not possible to achieve it due Prrxl1a and Prrxl1 specific C-terminal sequence, used as baits, to activate reporter genes transcription in the absence of any prey fused to an activation domain. Thus, the Yeast-Two-Hybrid approach used was not successful. On the other hand, aiming to characterize Prrxl1 genetic program in the developing spinal cord, was performed Chromatin Immunopercipitation followed by massive parallel sequencing (ChIP-Seq) using a Prrxl1 specific antibody and chromatin from the murine E14.5 dorsal half of the spinal cord. This approach allowed the identification of 939 candidate genes associated with the Prrxl1 binding sites obtained by ChIP-Seq. However, DNA-protein interaction did not mean that there is a transcriptional regulation. Hence, the second objective of the present study was to select a set of candidate genes from ChIP-Seq list, and to analyze their expression pattern in spinal cord and DRG, in wild type and Prrxl1-/- mice by in situ hybridization and Real Time PCR. Our study revealed that Dscaml1 and Sema3F are Prrxl1 direct targets in spinal cord and DRG, and Cdh4 and Efna5 are Prrxl1 direct targets only in DRG. These results suggest that Prrxl1 is involved in axon guidance and neuronal connectivity and, therefore, are in agreement with the Prrxl1-/- mice phenotype.

A correcta percepção dos estímulos sensitivos pelo cérebro envolve tipos diferentes de neurónios sensitivos e requer circuitos funcionais específicos. Como se diferenciam os neurónios sensitivos nos vários subtipos e de que forma estabelecem sinapses funcionais são questões centrais que permanecem, em grande parte, sem resposta. Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os fatores de transcrição “Basic helix-loop-helix” (bHLH) e homeodomínio (HD) desempenham um papel essencial no controlo da proliferação, especificação, diferenciação e estabelecimento de circuitos neuroniais. Entre os fatores de transcrição envolvidos na diferenciação de neurónios sensitivos, o Prrxl1 (Paired related homeobox protein-like 1) tem merecido um interesse especial do nosso laboratório, uma vez que o Prrxl1 está especificamente envolvido na diferenciação de neurónios nociceptivos dos gânglios raquidianos (GRs) e da medula espinhal (ME). O Prrxl1 é um dos poucos factores de transcrição que se expressam especificamente em neurónios sensitivos periféricos e nos neurónios da medula espinhal e tronco cerebral com que aqueles se articulam. Este tipo de expressão foi entendido como sugestivo de que o Prrxl1 desempenhe papel especial no estabelecimento de conexões entre o primeiro e o segundo neurónio da via sensitiva. De facto, a análise de murganhos transgénicos, knockout para o gene Prrxl1, revelou que este factor de transcrição pode estar envolvido em vários aspectos da diferenciação neuronal, incluindo migração, desenvolvimento da projecção axonal, bem como no comportamento nociceptivo normal no animal adulto. As várias funções em que o Prrxl1 parece estar envolvido apontam para a activação de um programa genético complexo. Resultados recentes do nosso laboratório mostram que o gene Prrxl1 origina dois transcritos, o Prrxl1a e o Prrxl1b, através do mecanismo de splicing alternativo. Além disto, a Prrxl1a apresenta vários estados de fosforilação cujo padrão varia ao longo do desenvolvimento do GR e da ME do murganho. Assim, a fosforilação parece ter um papel na regulação da actividade da Prrxl1a, no entanto, as cinases e fosfatases envolvidas neste processo, assim como outras proteínas que interajam com o Prrxl1a/b não são conhecidas. Um dos objectivos do presente estudo foi o de caracterizar o interatoma do Prrxl1 recorrendo ao sistema Yeast-Two-Hybrid. No entanto, tal não foi possível porque tanto a Prrxl1a como a sequência C-terminal específica da Prrxl1b usadas como iscos tinham por si só a capacidade de transactivar o gene repórter, sem o uso de presas em fusão com o domínio de activação. Deste modo, a estratégia do Yeast-Two-Hybrid utilizado não teve sucesso. Por outro lado, tendo por objectivo a caracterização do programa genético do Prrxl1 na ME em desenvolvimento, foi realizada no nosso laboratório uma experiência de Imunoprecipitação da Cromatina seguida de uma sequenciação massiva em paralelo (ChIP-Seq) usando um anticorpo específico para a Prrxl1 e cromatina da região dorsal da espinal medula de embriões com 14,5 dias de desenvolvimento embrionário (E14,5). Esta abordagem permitiu a identificação de 939 genes candidatos, associados com os locais de ligação da Prrxl1 obtidos por ChIP-seq. No entanto, a interação entre uma proteína e o DNA não significa que exista regulação da transcrição. Assim, outro objectivo deste trabalho foi o de seleccionar um grupo de genes candidatos a partir da lista de ChIP-seq e de analisar a sua expressão em GRs e ME de murganhos “wild type” e “knockout” para o gene Prrxl1, usando como metodologia experimental a hibridação in situ e o PCR em tempo real. Neste trabalho, mostramos que os genes Dscaml1 e Sema3F são genes alvo diretos do Prrxl1 nos GRs e ME, e os genes Cdh4 e Efna5 são apenas nos GRs. Estes resultados sugerem que o Prrxl1 regula a expressão de genes envolvidos na orientação das projeções axonais e conetividade neuronial, estando em linha com o fenótipo observado nos murganhos Prrxl1-/-.
description: Mestrado em Biologia Aplicada
URI: http://hdl.handle.net/10773/7703
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UA - Dissertações de mestrado

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