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 SugE: protein involved in TBT resistance in A. molluscorum Av27
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/7463

title: SugE: protein involved in TBT resistance in A. molluscorum Av27
other titles: SugE: proteína envolvida na resistência ao TBT em A. molluscorum Av27
authors: Moreira, Rafael Mascaretti
advisors: Barroso, Sónia Alexandra Leite Velho Mendo
keywords: Ecotoxicologia
Ecossistemas aquáticos - Contaminação
Biotecnologia ambiental
Microorganismos
Aeromonas
Proteinas - Simulação
Tributiltin - Aspectos ambientais
issue date: 30-Nov-2011
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: The extensive use of organotin compounds and their subsequent discharge into the environment has led to contamination of marine and freshwater environments. Several studies shown that these compounds are involved in the phenomenon known as "imposex" in gastropods and may affect other organisms, including humans. It is thus of great importance, the removal of these contaminants in ecosystems. It was isolated species of the genus Aeromonas with high resistance to tributyltin (TBT). Aeromonas molluscorum Av27, is able to degrade TBT into less toxic compounds such as dibutyltin (DBT) and monobutyltin (MBT). It was demonstrated that the gene sugE A. molluscorum Av27 (sugE-Av27), was linked to TBT resistance in this strain. This gene codes a protein homologous to SugE, a member of the small multidrug resistance protein family (SMR). Given the possible application of Av27 in bioremediation, it is necessary to study the whole mechanism of resistance and optimize the degradation of TBT in this Av27 strain. Thus, the objectives of this study were: (i) verify the over-expression of SugE A. molluscorum Av27 (SugE-Av27) protein in Av27 in the presence of TBT; (ii) clone Av27-sugE gene into an Escherichia coli expression system, which will allow further purification of the protein for future characterization studies; (iii) development and optimization of a simple and rapid method to evaluate the TBT degradation/toxicity. In the protein extracts obtained it was not possible to identify the protein SugE-Av27. However, analysis by mass spectrometry, suggested that genes related to protein synthesis, glycolysis and ATP synthesis are being overexpressed in response to TBT exposure. An enzyme, D-alanine-D-alanine ligase, involved in cell wall synthesis, also appears to be overexpressed. Indicating that one of the resistance mechanisms can be related to the maintenance of the cell wall stability. For the purification of the protein under study, the gene sugE-Av27 was inserted into the vector pET24 and cloned in E.coli BL21 (DE3). After four hours of induction with IPTG, there was an increased expression of SugE-Av27 protein indicated by Western blot analysis. Micrococcus luteus was shown to be sensitive to TBT, thus can be applied as an indicator species in degradation bioassays of TBT by Av27. It was evidenced a decrease of the TBT toxicity to M. luteus after a period of 54h, therefore this compound is being degraded by Av27. New perspectives opened up with this work in relation to TBT resistance mechanisms in Av27. To corroborate these results, further studies are needed including an analysis of the genes up- and downregulated in Av27 to TBT exposure and attempt some variations in the physicochemical parameters in the degradation bioassays.

O uso extensivo de compostos organostânicos e a sua consequente descarga no ambiente levou à contaminação dos ecossistemas marinhos e de água doce. Vários estudos mostram que estes compostos estão envolvidos no fenómeno conhecido como “Imposex” em gastrópodes e que podem afectar outros organismos, incluindo os seres humanos. É assim, de grande importância, a remoção destes contaminantes dos ecossistemas. Foi isolada e identificada uma espécie do género Aeromonas com elevada resistência ao tributilestanho (TBT). A estirpe, Aeromonas molluscorum Av27, é capaz de degradar o TBT em compostos menos tóxicos como o dibutilestanho (DBT) e o monobutilestanho (MBT). Foi demonstrado que nesta estirpe o gene sugE A. molluscorum Av27 (sugE-Av27) está implicado na resistência ao TBT. Este gene codifica para uma proteína homóloga à SugE, um membro da família das “small multidrug resistance” (SMR). Dada a possível aplicação de Av27 em processos de biorremediação, torna-se necessário aprofundar o estudo de todo o mecanismo de resistência nesta estirpe, bem como, optimizar o processo de avaliação da degradação do TBT pela estirpe Av27. O presente trabalho teve como objectivos: (i) verificar se, na presença de TBT, o aumento de expressão do gene sugE-Av27 se traduz num aumento da quantidade de proteína; (ii) clonar o gene sugE-Av27 num sistema de expressão em Escherichia coli, para posterior purificação da proteína; (iii) desenvolver e optimizar um método simples e rápido para detectar a degradação do TBT. Não foi possível identificar a proteína SugE A. molluscorum Av27 (SugE-Av27) nos extractos proteicos. Contudo, da análise por espectrometria de massa, pode-se inferir que outros genes relacionados com a síntese proteica, glicólise e síntese de ATP estão a ser sobrexpressos em resposta à exposição ao TBT. Uma enzima, D-alanina-D-alanina ligase, envolvida na síntese da parede celular, parece estar também a ser sobrexpressa, indicando que um dos mecanismos de resistência possivelmente envolverá a manutenção da estabilidade da parede celular. Com vista à purificação da proteína em estudo, o gene sugE-Av27 foi inserido no vector pET24 e clonado em E. coli BL21 (DE3). Após quatro horas de indução com IPTG verificou-se um aumento da expressão da proteína SugE-Av27, por análise em Western blot. Na tentativa de desenvolver um método rápido para detecção de TBT em laboratório e sendo Micrococcus luteus sensível ao TBT, utilizou-se está espécie indicadora em bioensaios de degradação do TBT pela Av27. Assim, verificou-se que após um período de 54h a toxicidade do TBT diminuiu, sendo então provável que este composto esteja a ser degradado pela estirpe Av27. No presente trabalho iniciaram-se alguns estudos que poderão, no futuro, contribuir para o esclarecimento do mecanismo de resistência /degradação ao TBT pela estirpe Av27. Contudo, mais estudos são necessários, nomeadamente no que refere à análise da expressão dos genes que estão a ser sub- e sobre-expressos em Av27 em resposta à exposição ao TBT e ainda no que refere ao bioensaio para avaliar a degradação do TBT por Av27.
description: Mestrado em Microbiologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/7463
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UA - Dissertações de mestrado

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