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 PCR em tempo real: métodos e aplicações
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/7230

title: PCR em tempo real: métodos e aplicações
authors: Oliveira, Tânia Maria dos Santos
advisors: Souto, Luís
keywords: Toxicologia
Ácido desoxirribonucleico
Reacção em cadeia de polimerase
Genética quantitativa
Amplificação de genes
issue date: 2010
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica fundamental nos laboratórios actuais, que revolucionou a detecção de RNA e DNA. Recentemente, uma nova técnica designada PCR em tempo real, evoluiu da técnica de PCR convencional, com o objectivo de minimizar as suas numerosas limitações. Esta técnica, também conhecida como PCR Quantitativa ou PCR em tempo real Quantitativa é um método de quantificação e amplificação simultânea do DNA. A PCR em tempo real é baseada na detecção e quantificação de um composto fluorescente (durante as primeiras fases da PCR), assentando num princípio básico de que o aumento significativo da quantidade de produto da PCR está correlacionado com a quantidade inicial do controle. A PCR em tempo real apresenta inúmeras vantagens relativamente à PCR tradicional. A recolha de dados ocorre durante a fase exponencial de crescimento da PCR, sendo por tal uma análise rápida e simples. Trata-se de uma técnica sem influência da amplificação não específica, podendo a amplificação ser controlada em tempo real. O risco de contaminação é baixo devido à ausência de processamento pós-PCR dos produtos resultantes. Além do mais, esta técnica requer apenas 3 picogramas de material, o que é cerca de 1000 vezes menos material genético face a ensaios convencionais. Finalmente, é uma técnica mais específica, sensível e reprodutível. No entanto, a PCR em tempo real apresenta algumas desvantagens designadamente, o elevado custo do equipamento e as elevadas exigências técnicas e científicas requeridas para o correcto manuseamento e manutenção do equipamento. A técnica da PCR em tempo real pode ser aplicada tanto em utilizações mais tradicionais da PCR como em novas aplicações às quais a PCR convencional responde de forma pouco ou menos eficaz, em áreas tão diversas como, saúde, forense e agricultura. As principais aplicações estão relacionadas com a quantificação da expressão génica, controle de qualidade e validação de ensaios, quantificação viral, detecção de agentes patogénicos, toxicologia forense quantificação de danos no DNA, genotipagem, determinação pré-natal do sexo de células, dosagem génica, oncologia clínica, quantificação de proteínas, microbiologia, análise e quantificação de DNA mitocondrial e de DNA nuclear, qualidade do DNA, estudo da presença de níveis de OGM nos alimentos, certificação, entre muitas outras aplicações possíveis. O principal objectivo desta tese de Mestrado visou apresentar o estado da arte da técnica da PCR em tempo real, nomeadamente, descrição da técnica, comparação com a PCR convencional, apresentação das vantagens e desvantagens, caracterização e análise das plataformas implantadas no mercado e análise e discussão detalhada de aplicações reais e potenciais.

The polymerase chain reaction (PCR) is a key technique in worldwide laboratories, which revolutionized the detection of RNA and DNA. Recently, a new technique, named Real-Time PCR, emerged from the traditional PCR, aiming to remove many of the limitations of standard end-point PCR. This technique, also known as Quantitative PCR, Real-Time Quantitative PCR, or RTQ-PCR is a method of simultaneous DNA quantify and amplification. The Real-Time PCR is based on the detection and quantitation of a fluorescent reporter (during the early phases of the PCR), being the first significant increase in the amount of PCR product (threshold cycle) correlated to the initial amount of target template. Real-Time PCR provides distinct advantages over traditional PCR detection. The data collection occurs during the exponential growth phase of PCR, being a quick and simple procedure. That is not influenced by non-specific amplification and the amplification can be monitored in real-time. The contamination risk is low due to the absence of post-PCR processing of products. Furthermore, this technique only requires 3 picogram of material which is 1000-fold less sample comparing to the conventional assays. Finally, it is most specific, sensitive and reproducible technique. However, Real-Time PCR present some disadvantages, namely the high equipment cost, the setting up requires high technical skill and support and is not ideal for multiplexing. Real-Time PCR can be applied to traditional PCR purposes as well as new applications that would have been less effective with traditional PCR, in several areas such as health, forensics and agriculture. Some applications are related to quantitation of gene expression, array verification, quality control and assay validation, viral quantitation, forensics toxicology, pathogen detection, DNA damage measurement, genotyping, among others. The main goal of this Master thesis is describe the state of the art of the Real-Time PCR, namely, showing a overview of the technique and its procedure and comparing with the conventional PCR technique, presenting their advantages and disadvantages, characterizing and analysing the main platforms used in the national and international market and analysing and discussing potential and real applications.
description: Mestrado em Toxicologia e Ecotoxicologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/7230
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UA - Dissertações de mestrado

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