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 Glycogen synthase kinase 3ß modulation in axonal regeneration
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/5284

title: Glycogen synthase kinase 3ß modulation in axonal regeneration
other titles: Modulação da Glycogen Synthase Kinase 3ß na regenaração axonal
authors: Pimentel, Helena Isabel da Costa Antunes
advisors: Liz, Márcia
Silva, Odete Beirão Cruz e
issue date: 2011
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: A espinal medula de mamíferos adultos não possui capacidade de regeneração ao contrário do nervo periférico lesionado. De forma a compreender os mecanismos que potenciem a regeneração do sistema nervoso central, o modelo de lesão condicionante foi usado. Neste, uma lesão no ramo periférico dos neurónios da raiz dorsal cerca de uma semana antes de uma lesão no ramo central dos mesmos neurónios, promove a regeneração do último. Através de abordagens proteómicas concluiu-se que a Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) e proteínas que interagem com esta, estavam diferencialmente regulados após lesão condicionante, explicando possivelmente o maior potencial regenerativo nesta condição. Com este projecto, pretendemos compreender o mecanismo de regulação da GSK3β que leva à regeneração axonal. Primeiro observámos nos neurónios da raiz dorsal, um aumento da fosforilação da Akt (a cinase que inactiva a GSK3β através de fosforilação da S9), um aumento da pGSK3β(S9) (forma inactiva) e diminuição dos níveis de pGSK3β(Y216) (forma activa) após lesão condicionante validando os resultados da proteómica. Relativamente à espinal medula (local de lesão), verificou-se a diminuição de pGSK3β(Y216) após lesão condicionante em comparação com a lesão na espinal medula sugerindo que a GSK3β se encontra inibida após lesão condicionante por modulação deste resíduo. Relativamente aos substratos da GSK3β, na espinal medula a fosforilação do CRMP2 encontra-se diminuída e os níveis de pMAP1b encontram-se aumentados após lesão condicionante. De forma a perceber o papel da fosforilação da GSK3β(Y216) na regeneração axonal tratámos culturas de neurónios da raiz dorsal condicionados com ácido lisofosfatídico, um indutor da fosforilação da GSK3β(Y216), o qual reduziu o efeito de condicionamento. Para além disso, o inibidor VII (inibidor da GSK3) provocou um aumento da extensão axonal em neurónios adultos da raiz dorsal possivelmente por diminuição da fosforilação da GSK3β(Y216). Analisámos também o mecanismo responsável pela modulação da fosforilação da GSK3β(Y216). Os nossos resultados sugerem que a Fyn seja um bom candidato, uma vez que observámos na espinal medula níveis aumentados da forma inactiva da Fyn após lesão condicionante. De forma a determinar o papel da GSK3β in vivo, a regeneração axonal foi avaliada utilizando ratinhos GSK3βS9A knockin (KI). Tanto as culturas de neurónios da raiz dorsal de ratinhos GSK3βS9A KI não lesionados como após condicionamento, tiveram crescimento axonal semelhante à dos ratinhos wild type mostrando que a modulação da GSK3β através de fosforilação da GSK3β(S9) não é necessária para o efeito de condicionamento. Os nossos resultados sugerem que a fosforilação da GSK3β(Y216) tem um papel importante na regeneração axonal apesar de a literatura se focar no mecanismo inibitório da fosforilação da GSK3β(S9). A identificação da importância que a GSK3β possa ter no potenciamento da regeneração axonal após lesão condicionante, pode ser positiva no desenvolvimento de novas terapias para lesões na espinal medula.

The adult mammalian spinal cord fails to regenerate, contrarily to the injured peripheral nerve. In order to shed light on the mechanisms enabling central nervous system axonal regeneration, the conditioning lesion model was used. In this model, an injury in the peripheral branch of the dorsal root ganglia (DRG), approximately one week prior to an injury in the central branch of the DRG, promotes regeneration of the latter. To identify putative candidates differentially regulated in the DRG following conditioning lesion in comparison to spinal cord injury (SCI) alone, two proteomic approaches were used. From these analysis, Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) and interacting proteins, were identified as being differentially regulated following conditioning lesion, possibly explaining the increased regeneration in this condition. In this study we aimed to understand how GSK3β is modulated in order to promote axonal regeneration. We observed in the DRG increased levels of pAkt (the kinase that inactivates GSK3β through S9 phosphorylation), an increase of pGSK3β(S9) (inactive form) and decreased pGSK3β(Y216) (active form) levels in the conditioning lesion model, validating the proteomic results. Concerning the spinal cord injury site, we observed a decrease in pGSK3β(Y216) after conditioning lesion when compared to SCI, suggesting that the GSK3β activity is downregulated through modulation of this residue. Regarding the GSK3β substrates, CRMP2 phoshorylation levels are decreased and MAP1b is increasingly phosphorylated following conditioning lesion when compared with SCI alone in the spinal cord injury site. In order to evaluate the role of GSK3β(Y216) phosphorylation in axonal regeneration we treated conditioned DRG neurons with lysophosphatidic acid, an inducer of Y216 phosphorylation, which reduced the conditioning effect. On the other hand, the GSK3 inhibitor VII increased axon growth of adult DRG neurons possibly through a decrease of GSK3β(Y216) phosphorylation. We also analysed the mechanism responsible for the modulation of GSK3β(Y216) phosphorylation. Our results suggest that Fyn is a good candidate as we observed increased levels of the inactive form of Fyn after conditioning lesion in the spinal cord injury site. To evaluate the role of GSK3β in vivo, we assessed axonal regeneration in GSK3βS9A knockin (KI) mice. Both uninjured and conditioned DRG neuronal cultures from GSK3βS9A KI mice had similar neurite outgrowth to cultures performed with wild type mice showing that modulation of GSK3β through GSK3β(S9) phosphorylation is not required for the conditioning effect. In summary, our results suggest that GSK3β(Y216) phosphorylation has an important role in axonal regeneration, though the literature focuses on the inhibitory mechanism of GSK3β(S9) phosphorylation. Determining the role of GSK3β in the promotion of axonal regeneration after conditioning lesion, might impact in the development of new therapies for SCI.
description: Mestrado em Biomedicina Molecular
URI: http://hdl.handle.net/10773/5284
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UA - Dissertações de mestrado

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