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 Mucolipidoses II e III: espectro mutacional e correlação com o fenótipo clínico
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/4376

title: Mucolipidoses II e III: espectro mutacional e correlação com o fenótipo clínico
authors: Encarnação, Marisa Alexandra Rego da
advisors: Silva, Edgar da Cruz e
Alves, Sandra
keywords: Métodos biomoleculares
Lisossomas
Doenças genéticas
Expressão genética
Genotipos
Fenotipos
issue date: 2007
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: As doenças lisossomais de sobrecarga (DLS) são um grupo de doenças hereditárias do metabolismo, caracterizadas pela deficiência em determinadas vias catabólicas intralisossomais. A maioria das DLS envolve defeitos em proteínas lisossomais solúveis que são endereçadas para o lisossoma pela via da manose-6-fosfato (M6P). A síntese da M6P inicia-se com a transferência da GlcNAc-1-fosfato para manoses específicas nas enzimas lisossomais recémsintetizadas, este passo é catalizado pela enzima N-acetilglucosaminil-1- fosfotransferase (GlcNAc-fosfotransferase). Após a aquisição da marcação M6P, as enzimas lisossomais são reconhecidas por receptores que direccionam o seu transporte até aos lisossomas. Na ausência de actividade da GlcNAc-fosfotransferase, as enzimas lisossomais são secretadas. Esta deficiência é conhecida por Mucolipidose tipo II (ML II ou doença I-cell) uma doença autossómica recessiva caracterizada por um atraso psicomotor muito grave e que leva à morte do doente na primeira década de vida. A Mucolipidose tipo III (ML III ou polidistrofia pseudo- Hurler) é uma doença menos grave em que a sobrevivência até à idade adulta é possível. Na ML III a actividade da GlcNAc-fosfotransferase em vez de ausente está diminuída. A GlcNAc-fosfotransferase é uma enzima hexamérica: α2β2γ2, codificada por 2 genes diferentes. O gene que codifica a subunidade γ (GNPTG) localiza-se no cromossoma 16. As subunidades α e β são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossoma 12, sendo originadas após o processamento proteolítico do precursor α/β. Alterações no gene GNPTAB podem originar a ML II ou a ML IIIA, enquanto que mutações no gene GNPTG dão origem à ML IIIC, que ao nível das características clínicas e bioquímicas não é distinguível da ML IIIA. Este trabalho teve como principais objectivos: 1) a caracterização genotípica de doentes portugueses com ML II e ML III para os genes GNPTAB e GNPTG; 2) a obtenção de dados acerca do espectro mutacional das ML II e ML III e da sua distribuição em Portugal; 3) a implementação de estratégias de diagnóstico molecular para estas patologias; 4) a avaliação da causalidade das mutações encontradas no que respeita ao seu impacto ao nível do mRNA e previsão dos seus efeitos na estrutura e função da proteína; 5) o estabelecimento de uma correlação entre a presença de uma determinada mutação nos genes GNPTAB e GNPTG e o fenótipo clínico. Foram estudados dez doentes não consanguíneos (nove portugueses e um de origem indiana) classificados clinicamente como ML II ou ML III. Nestes doentes as mutações foram identificadas através de uma estratégia analítica que englobou o estudo quer do cDNA quer do gDNA. Foram identificadas cinco mutações distintas no gene GNPTAB. Destas, três mutações são novas (p.E667X, p.I403T e c.440delC) e duas estavam previamente descritas na literatura (c.3503delTC e p.S399F). Foram também encontradas duas mutações novas no gene GNPTG, a c.639delT e a c.610- 1G> T. Verificou-se que as mutações previamente descritas no gene GNPTAB (S399F e 3503delTC) estão associadas, nos doentes estudados neste trabalho, a fenótipos similares aos descritos em outros doentes que apresentavam estas mutações. Na presença das mutações novas I403T, E667X e 440delC (esta em homozigotia) os doentes apresentavam na presença da primeira um fenótipo compatível com ML IIIA e no caso das últimas duas um fenótipo característico de ML II. O doente com alterações no gene GNPTG apresenta um fenótipo compatível com ML IIIC. Este estudo permitiu também clarificar a classificação clínica inicial, o que levou ao diagnóstico mais preciso do tipo de Mucolipidose. A mutação 3503delTC constitui 50% dos alelos identificados nos doentes portugueses. Uma vez que esta mutação já tinha sido descrita anteriormente como sendo frequente em doentes de origem árabe, foi efectuada uma análise haplotípica para esclarecer se a presença desta mutação em ambas as populações se deve a um efeito fundador ou se, pelo contrário, resulta de eventos mutacionais independentes. Os dados obtidos parecem indicar que estamos na presença de um evento mutacional único e que, possivelmente, o alelo mutante presente nos dois grupos de doentes tem uma origem comum. Os estudos de expressão dos genes GNPTAB e GNPTG por qRT-PCR mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA GNPTAB na presença de mutações frameshift e nonsense no gene GNPTAB (440delC, 3503delTC e E667X). Nesta situação, a redução dos níveis de mRNA GNPTAB, pode ser explicada pelo aparecimento prematuro de codões STOP o que torna bastante provável que os transcritos sejam alvo do mecanismo NMD. Na presença das mutações missense (S399F e I403T) a diminuição dos níveis de mRNA GNPTAB não é significativa. O doente com alterações no gene GNPTG (heterozigótico composto 610-1G>T/639delT) também apresentava níveis de mRNA GNPTG bastante reduzidos relativamente ao valor médio dos controlos. Os resultados da análise mutacional efectuada constituem, até à data, os únicos dados de caracterização molecular destas patologias na população portuguesa contribuindo também, para um melhor conhecimento a nível mundial das bases moleculares desta doença. Por outro lado, estes estudos são extremamente importantes na medida em que a análise mutacional permitirá a realização de um diagnóstico pré-natal molecular e um diagnóstico mais preciso aos familiares de doentes recentemente diagnosticados.

Lysosomal storage diseases (LSD) are a group of inherited metabolic diseases characterised by the impairment of the intralysosomal catabolic pathways. The majority of LSD involve defects in soluble lysosomal proteins that are targeted to the lysosome by the mannose 6-phosphate (M6P) pathway. The initial step in M6P synthesis is the transfer of GlcNAc-1-phosphate to selected mannoses of newly synthesized lysosomal enzymes, which is catalysed by Nacetylglucosamine 1-phosphotransferase (GlcNAc-phosphotransferase). Following acquisition of the M6P marker, lysosomal enzymes can be recognized by specific receptors that target their transfer to lysosomes. In the absence of GlcNAc-phosphotransferase activity lysosomal enzymes are secreted from the cell. This defect is recognized as mucolipidosis II (ML II or Icell disease) an autosomal recessive disease characterised by severe psychomotor retardation often resulting in death in the first decade of life. Another type of mucolipidosis, mucolipidosis III (ML III or pseudo-Hurler polydystrophy) is a milder disease and survival into adulthood is possible. In ML III GlcNAc-phosphotransferase activity is reduced rather than absent. GlcNAc-phosphotransferase is a multimeric enzyme, α2β2γ2, encoded by two genes. The gene for the γ subunit (GNPTG) is located on chromosome 16. The α and the β subunit are encoded by the GNPTAB gene, which is located on chromosome 12. Proteolytic processing of the α/β precursor generates the individual α and β subunits. Defects in GNPTAB result in mucolipidosis II and IIIA whereas mutations in GNPTG were only found in ML IIIC patients. ML IIIC is biochemical and clinically indistinguishable from ML IIIA. The main aims of the present work consisted in: 1) performing the molecular characterisation of Portuguese patients with ML II and ML III for the GNTPAB and GNPTG genes; 2) to obtain data about the mutational spectrum and the frequency distribution of causative mutations in Portugal 3) the development of a molecular diagnosis strategy; 4) the evaluation of the impact of novel mutations at mRNA and the predition of its effects on protein structure and function and 5) the establishment of a genotype-phenotype correlation. We have studied ten nonconsanguineous patients (nine Portuguese and one of Indian origin) with ML II or ML III. The mutations were identified by the study of both cDNA and gDNA. We have identified five different mutations in the GNPTAB gene. Two mutations were previously described in the literature: S399F and c.3503delTC and three are new mutations: c.440delT, I403T and E667X. In the GNPTG gene we have found two novel mutations: c.610-1G>T and c.639delT. Patients carrying mutations previously described in the GNPTAB gene (S399F and 3503delTC) presented similar phenotypes to those manifested by other patients with the same mutations described elsewhere. The present work enabled the establishment of a genotype-phenotype correlation for the novel mutations, I403T, E667X and 440delC (this one in homozygosity) showing that the first one seems to be associated with ML IIIA and the last two with the more severe ML II. The patient with mutations in the GNPTG gene (c.610-1G>T and c.639delT) presents a phenotype compatible with ML IIIC. The results obtained in this study also led to the revision of the initial clinical classification, some patients classified as ML II were after the molecular analysis classified as ML III (A or C) and vice-versa. An interesting result of our mutation analysis was that the most frequent disease allele among the Portuguese patients - c.3503delTC, which was harboured by 9 out the 18 mutant alleles (50%), was also the most common among a group of patients of Arab-Muslin origin studied by Bargal et al. (2006). This finding prompted us to perform a haplotypic analysis in order to address the question of whether the mutation had a single origin or, contrarily, whether it was a recurrent mutation. The results seem to indicate that in Portuguese and Arab Muslim patients the c.3503delTC disease chromosomes share a common origin. As to the mRNA expression, the values obtained by relative quantification using real time RT-PCR indicate that the presence of frameshift or nonsense mutations in the GNPTAB gene (c.440delC, c.3503delTC and p.E667X) was associated with a significant decrease in mRNA GNPTAB levels comparatively to the median controls value. Since these substitutions results in the formation of transcripts with premature termination codons, reduction in mRNA might reasonably be explained by the transcripts involvement in the NMD pathway. In the case of missense mutations (S399F and I403T) values of mRNA did not significantly differ from the median controls value. On the other hand, in the patient with alterations in the GNPTG gene (c.610-1G>T/c.639delT compound heterozygote) the mRNA GNPTG levels were found to be significantly decreased in comparison to the reference value. The results obtained with this study constitute, until now, the only molecular characterisation data of these pathologies in Portugal, contributing also to extend the knowledge of ML II and ML III causing mutations worldwide. Additionally, the strategies developed for mutation analysis, constitute valuable tools that will allow carrier detection and prenatal molecular diagnosis, leading to the improvement of genetic counselling with great benefits for the affected families.
description: Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
URI: http://hdl.handle.net/10773/4376
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