Identificação de radicais livres e produtos de oxidação de biomoléculas por MS

Abstract

A alteração estrutural de biomoléculas por acção de radicais livres resultantes de processos aeróbios, e mais especificamente em ácidos gordos insaturados, tem sido descrita como tendo um papel preponderante em patologias relacionadas com o envelhecimento. Esta tese tem como objectivo o uso da espectrometria de massa (MS) na identificação e caracterização estrutural de radicais livres de ácidos gordos, nomeadamente no ácido gordo ω-6, e em modelos progressivamente mais complexos, como as glicerofosfatidilcolinas (GPC) substituídas com ácidos gordos ω-9 e ω-6. Em resultado, e usando metodologia desenvolvida para a detecção de radicais livres, nomeadamente o uso de “trapas de spin”, foram identificados por MS vários radicais livres do ácido linoleico e de GPC sob a forma de aductos de spin. Estes resultaram da inserção de átomos de oxigénio na cadeia carbonada e de cisão da mesma após inserção de átomos de oxigénio. Após caracterização por espectrometria de massa tandem (MS/MS), verificou-se a presença de radicais centrados em átomos de carbono (alquilo) e de oxigénio (alcoxilo), tendo-se ainda verificado que a quebra da cadeia carbonada ocorreu preferencialmente no sentido da formação de radicais com o menor número de átomos de carbono. Em função dos radicais de GPC identificados por MS, verificou-se não existir uma relação entre a extensão da oxidação e o grau de insaturação, o que sugere um efeito retardador na reacção de peroxidação lipidica pela adição da “trapa de spin”. Esta observação parece ser corroborada pela identificação de mais de 50 produtos de oxidação não-radicalares para os 3 GPC na ausência da trapa de spin, tendo-se verificado uma relação directa entre a extensão das alterações estruturais e o grau de insaturação. De entre os produtos de oxidação nãoradicalares identificados, encontram-se vários isómeros estruturais, posicionais e estruturas isobáricas que foram caracterizados por MS associada à cromatografia líquida de alta eficiência. De salientar, que as diferenças observadas para os tempos de retenção dos produtos de cadeia curta com terminal aldeído e ácido carboxílico em diferentes GPC, sugerem que este procedimento poderá ser aplicado para o fraccionamento de amostras biológicas. A formação de produtos de cadeia curta com terminal aldeído em elevada abundância relativa permitiu a identificação de aductos GPC-peptídeo, tendo sido identificadas as vias de fragmentação preferenciais por MS/MS e que se verificou serem característico de aductos GPC-peptídeo. Em resumo, os dados obtidos mostraram ser possível a identificação por MS tanto de produtos radicalares como não-radicalares de biomoléculas contendo ácidos gordos. Mais, a predominância de produtos de oxidação de GPC modificados nos átomos de carbono mais próximos da cabeça polar, sugere um ataque preferencial dos radicais nos átomos de hidrogénio mais próximos da cabeça polar.

The radical peroxidation of lipids and phospholipids is an increasing topic of research due to the close association between lipid peroxidation products and age-related diseases. In this work, mass spectrometry was used for the identification and characterisation of lipid and phospholipid free radicals using the methodology developed for the detection of free radicals, namely the use of spin traps. For this, radical oxidation was performed on ω-6 unsaturated fatty acid and extended to progressive more complex structures, particularly diacylglycerophosphatidylcholines (GPC) containing ω-9 (oleic) and ω-6 (linoleic and arachidonic) fatty acids. Several intact and breakdown free radicals products of lipid and GPC were identified as spin adducts for the first time, and characterisation by tandem mass spectrometry (MS/MS) in association with reverse-phase chromatography (HPLC-MS/MS) allowed the assignment of such species to be carbon and oxygen centred radicals. The lipid breakdown products suggested that β-scission cleavage is selective towards the formation of the smaller alkyl radicals. Also, the intact free radicals identified for the 3 GPC suggested the occurrence of a “retarder” effect to the lipid peroxidation caused by the addition of the spin trap. The identification and characterisation by MS was extended to non-radical GPC products and the complexity of structures required previous separation method by reverse-phase chromatography prior to mass spectrometry detection (LC-MS) and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). More than 50 different structures were identified for only three phospholipids. Based on the LC-MS/MS data analysis, isomeric structures of long-chain products were differentiated and, short-chain products containing different terminal groups were differentiated by LC-MS data analysis according to the retention times, which was independent of the oxidised GPC. In this way, isobaric structures of short-chain products may be distinguished if present in complex mixtures. Adducts formed by covalent interaction between GPC alkenal products and peptides established in in vitro conditions were characterised by MS/MS. Upon fragmentation, the peptide-GPC adducts provided information about the peptide and the lipid moiety, which is characteristic of peptide-GPC adducts due to charge retention in the polar head. Altogether, MS is a suitable technique for the identification of both radical and non-radical products of fatty acids and phosphatidylcholines. Furthermore, the GPC peroxidation products identified in this study suggested that, during nonenzymatic phospholipid radical oxidation, bis-allylic hydrogen atoms closer to the polar head are preferably abstracted.