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 Detecção de M. tuberculosis resistente à isoniazida por PCR-TR
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/3081

title: Detecção de M. tuberculosis resistente à isoniazida por PCR-TR
authors: Ferro, Cristina Isabel Lopes
advisors: Domingues, Pedro Miguel Dimas Neves
Miranda, Anabela Medo
keywords: Biologia molecular
Tuberculose
Genes
issue date: 2005
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: A tuberculose é um grave problema de saúde pública responsável por cerca de 8 milhões de casos novos de doença e quase 3 milhões de mortes anualmente. O tratamento insuficiente ou inadequado, a toma irregular ou o abandono da terapêutica são as principais causas de desenvolvimento e multiplicação de estirpes resistentes aos fármacos utilizados. Por este motivo, o número de estirpes de Mycobacterium tuberculosis resistentes à rifampicina e isoniazida tem vindo a aumentar, tornando-se urgente a implementação de técnicas rápidas e fiáveis de detecção destas resistências. A isoniazida é um dos principais antibióticos administrados no tratamento da tuberculose. O mecanismo genético de resistência à isoniazida é complexo, envolvendo mutações nos seguintes genes: catalase-peroxidase (katG), enoil- (transportadora de acil) reductase (inhA), β-cetoacil-(transportadora de acil) sintetase (kasA) e alquil–hidroperóxido reductase (aphC). As mutações são geralmente polimorfismos de um só nucleótido, no mesmo codão, que dão origem a um outro aminoácido. O desenvolvimento de testes genotípicos pode contribuir para a rápida e adequada detecção da infecção por estirpes de M. tuberculosis resistentes aos fármacos. Para a elaboração desta dissertação implementou-se uma técnica de PCR em tempo real que permite identificar alterações no codão 315 do gene katG. Estas mutações estão relacionadas com o desenvolvimento de elevado nível de resistência à isoniazida. Estudaram-se 71 estirpes de M. tuberculosis que apresentam resistência a esta droga pelo método das proporções em Lowenstein-Jensen. Em 30% destas estirpes identificou-se a mutação no codão 315 do gene katG em que há substituição de uma serina por uma treonina. Não se verificou a presença de outras substituições nesta posição. A metodologia implementada permite a detecção correcta da resistência ao fármaco, abrindo a possibilidade de vir a ser usada em diagnóstico. Foi também possível a adaptação desta metodologia a DNA genómico extraído de esfregaços de exames directos positivos. Deste modo, tornou-se ainda mais rápida a determinação da presença de mutações, não sendo necessário aguardar o crescimento da estirpe. De futuro, prevê-se a aplicação desta metodologia rápida de forma a identificar mutações neste ou noutros genes que conferem resistências à INH e também a outras drogas utilizadas no tratamento da TB. Assim, torna-se possível caracterizar as estirpes clínicas existentes, e integrar estas técnicas na rotina laboratorial. ABSTRACT: Tuberculosis is a serious public health problem with one third of the world population infected with Mycobacterium tuberculosis. Inappropriate treatment can result in the development of resistant strains. For this reason, the early detection of drug resistance is essential for effective patient management and implementation of infection control measures. Because M. tuberculosis grows extremely slowly, susceptibility testing can take about 3 to 6 weeks to complete. However, in the last few years there has been a considerable progress in our understanding of the mechanisms of action of the anti-mycobacterial agents, and the basis of resistance to these compounds. As a result, a number of novel assays based on real-time PCR technology have recently been developed to detect mutations that confer resistance to antituberculous drugs. Isoniazid is a critical component of the first-line multidrug therapy of tuberculosis. The molecular basis of antitubercular isoniazid resistance is complex. Resistant strains have been found to contain mutations in the following genes: catalase – peroxidase (katG), enoyl-acyl carrier protein reductase (inhA), β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase (kasA) and alkylhydroperoxid redutase (ahpC). The present study reports the use of a real-time PCR assay, in a reference laboratory setting, that can detect mutations that confer resistance to isoniazid. Seventy one M. tuberculosis clinical isolates were identified as resistant to isoniazid by the proporthion method. From these, about 30% were found to have katG Ser315Thr mutation. Other substitutions in this position were not present. In addition, the methodology used allows detection of isoniazid resistance directly from DNA extracted from positive fluorescence stained slides, which contributes to an even more rapid diagnosis. In the future, novel real time PCR assays aimed at being used on a routine basis will be implemented in order to detect mutations responsible for resistance to other anti-tuberculous drugs.
description: Mestrado em Métodos Biomoléculares Avançados
URI: http://hdl.handle.net/10773/3081
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UA - Dissertações de mestrado

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