Production and purification of interferon alpha-2b from Escherichia coli cultures using alternative platforms

Abstract

A indústria biofarmacêutica tem vindo a desenvolver diferentes tipos de biofármacos para o tratamento de diversas doenças. A maioria das proteínas terapêuticas são produzidas através da tecnologia do DNA recombinante, e purificadas utilizando técnicas convencionais, tais como a precipitação com sais, eletroforese e cromatografia. O interferão alfa-2b (IFNα-2b) é uma proteína terapêutica de ação imunomoduladora com atividade antiviral e antiproliferativa, que é geralmente obtida a partir de culturas de Escherichia coli, e utilizada no tratamento de doenças humanas, tais como a hepatite C, melanomas, alguns linfomas e leucemias, entre outras. Embora a fase de produção recombinante do IFNα-2b já tenha sido amplamente estudada e otimizada, a sua recuperação e purificação assumem-se como os passos economicamente limitantes do processo global de produção. Neste estudo, o IFNα-2b foi produzido na forma de corpos de inclusão utilizando culturas de BL21, no meio SOB, após 3 h de indução. A recuperação desta fração englobou vários passos, tendo sido alcançado um protocolo final que inclui: 1) Lavagem com Triton-X a 1%; 2) Lavagem com ureia a 4 M; e 3) Solubilização em meio alcalino, com ureia a 8 M. Alterando as condições de produção conseguiu-se também produzir e recuperar parte da proteína alvo na forma solúvel, embora com menor rendimento. O IFNα-2b previamente solubilizado foi purificado através de cromatografia aniónica, tendo sido obtido na sua forma biologicamente ativa com uma pureza superior a 95%. Como técnica alternativa de purificação utilizaram-se sistemas aquosos bifásicos constituídos por vários líquidos iónicos e tampão fosfato. Apesar de os resultados serem menos promissores, este estudo permitiu estudar plataformas alternativas para a recuperação e purificação do IFNα-2b através da aplicação de sistemas aquosos bifásicos.

The biopharmaceutical industry has been developing various biopharmaceutical possibilities for the treatment of several diseases. Most therapeutic proteins are produced through the recombinant protein technology and purified using traditional techniques, such as precipitation with salts, electrophoresis and chromatography. Interferon alfa-2b (IFNα-2b) is a therapeutic protein with immunomodulatory action and antiviral and antiproliferative activities, usually produced by Escherichia coli cultures, and used in the treatment of several human diseases, such as hepatitis C, melanomas, some lymphomas and leukemias, among others. Although the recombinant production of IFNα-2b has already been extensively studied and optimized, its recovery and purification correspond to the economically limiting steps of the overall production process. In this study, IFNα-2b was produced in the form of inclusion bodies using BL21 cultures, in SOB medium, after 3 h of induction. The recovery of this fraction involved several steps, and a final protocol was developed: 1) Washing with Triton-X at 1%; 2) Washing with urea at 4 M; and 3) Solubilization in alkaline medium with urea at 8 M. By changing the production conditions, it was also possible to produce and recover part of the target protein in the soluble form, yet with a lower yield. The solubilized IFNα-2b was purified using anion-exchange chromatography, and obtained in a biologically active form with a purity higher than 95 %. As an alternative purification technique, aqueous two-phase systems composed of several ionic liquids and a phosphate buffer were investigated. Although the results obtained are less promising, this study allowed the evaluation of alternative platforms for the recovery and purification of IFNα-2b by the application of aqueous two-phase systems.