Solubilization of membrane proteins using ionic liquids

Abstract

The main goal of this work consists on the study of the ability of ionic liquids (ILs) to extract membrane proteins from biological membranes while keeping their integrity in aqeuous solutions. Since typical surfactants are mainly used for this purpose, ILs are here investigated as a new class of extraction agents. For the evaluation of the ILs solvation ability power, four proteins were selected to be overexpressed in Escherichia coli and to be used as model proteins, namely the Outer Membrane Protein F (OmpF) and Outer Membrane Protein C (OmpC), that are β-barrel proteins, and two bacteriorhodopsins, Haloarcula marismortui (HmBRI) and Haloarcula walsbyi (HwBR), that α-helix proteins. In this work, the investigations carried out with OmpC failed during cloning and OmpF failed during the purification step. On the other hand, the two bacteriorhodopsins were expressed and purified successfully. Although some adjustments (mainly the His-tag) must be performed to improve the expression and the purification level, 1 mg/L of HmBRI and 0.1 mg/L of HwBR were purified. The protein HmBRI was then chosen as a model protein to test the extraction ability of several aqeuous solutions of ILs. Its interesting feature of producing solutions and pellets with a purple colour, and its specific absorbance at 552 nm, make of HmBRI an excellent model protein since it can be easily monotired by Vis-spectroscopy and analysis of its colour. Iimidazolium-, phosphonium-and cholinium-based ILs were investigated in several concentrations in aqueous solutions. None of the ILs studied revelaed to be able to extract HmBRI without denaturation. However, cholinium decanoate was able to extract a higher amount of protein from the biological membrane compared to the commercial detergent decyl maltoside. Mixtures using cholinium decanoate and decyl maltoside were then used to extract the HmBR altough no further improvements on the extraction were observed. Since HmBRI is reported as a good fusion tag for other membrane proteins, avian specific antibodies (polyclonal) were finally produced by immunizing quails to evaluate the performance of HmBRI as a fusion tag.

O objetivo principal deste trabalho consistiu no estudo da capacidade de líquidos iónicos para extrair proteínas de membrana de membranas biológicas, assim como em manter a sua integridade em solução aquosa. Para a avaliação da capacidade de extração, foram selecionadas quatro proteínas para sobreexpressar em Escherichia coli, nomeadamente Outer Membrane Protein F (OmpF) e Outer Membrane Protein C (OmpC), que são proteínas em barril-β, e duas bacteriorodopsinas, Haloarcula marismortui (HmBRI) e Haloarcula walsbyi (HwBR), que são compostas por hélices-α. Infelizmente a produção de OmpC falhou durante o passo de clonagem enquanto que a obtenção de OmpF falhou durante o passo de purificação. Por outro lado, as duas bacteriorodopsinas foram expressas e purificadas com sucesso. Embora alguns ajustes (principalmente ao nível da His-tag) devam ainda ser realizados para melhorar a expressão e a purificação num futuro próximo, por cada litro de cultura foram purificados 1 mg de HmBRI e 0,1 mg de HwBR. A proteína HmBRI foi finalmente escolhida como proteína modelo para testar a capacidade de extração e solubilização de vários líquidos iónicos. A sua característica interessante de produzir soluções e pellets com cor roxa, assim como a sua absorvência específica a 552 nm, faz da HmBRI uma excelente proteína modelo facilmente monitorizada.Os líquidos iónicos estudados são derivados de catiões imidazólio, fosfónio e colinio. De um modo geral, nenhum líquido iónico foi capaz de extrair HmBRI sem a desnaturar. No entanto, o decanoato de colinio foi capaz de extrair mais proteínas da membrana biológica em comparação com o detergente comercial, decilo maltosideo. Por fim, foram estudadas misturas de decanoato de colina e surfactante comercial para extrair, apesar de os resultados serem semelhantes ao quando utilizando apenas líquido iónico. Uma vez que a HmBRI é uma boa proteína de fusão para outras proteínas de membrana, foram produzidos anticorpos específicos de aves (policlonais) pela imunização de codornizes, sendo estes anticorpos posteriormente purificados a partir de gema de ovo. Estes anticorpos são muito úteis na investigação de HmBRI como tag fusão.