Modulação da sensibilidade a drogas quimioterapêuticas através de mecanismos epigenéticos

Abstract

O cancro colo-rectal (CRC) é um problema de saúde na sociedade Ocidental, sendo o terceiro tipo de cancro mais comum. O estudo de padrões genéticos não é o suficiente para definir a suscetibilidade humana para uma patologia em particular. O CRC pode resultar da acumulação de alterações genéticas e epigenéticas. A epigenética é definida como um estudo de mudanças hereditárias na expressão dos genes, sem alterações na sequência de nucleótidos, sendo que o mecanismo epigenético mais explorado é a metilação de ADN em regiões promotoras. O fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) caracteriza o CRC e, neste caso, ocorre o silenciamento de genes supressores tumorais por hipermetilação. A metilação anormal do promotor de MLH1 ocorre em aproximadamente 80% dos casos de CRC esporádico. Ao contrário das mutações genéticas, o silenciamento epigenético pode ser reativado por moléculas que atuam como modificadores epigenéticos (por exemplo, 5-azacitidina - 5-Aza) através da inibição de ADN metiltransferase. Neste estudo explorou-se uma nova aplicação do ensaio cometa - o CoMeth (desenvolvido pelo nosso grupo) - com o objetivo de avaliar os efeitos epigenéticos na expressão de MLH1. Para isso, foi utilizada uma linha celular com deficiências no sistema MMR, cujo MLH1 está epigeneticamente silenciado pela hipermetilação do promotor e por conseguinte, não apresentará cometas em resposta ao MNU devido à falta de MMR funcional. Inicialmente confirmou-se que 5-Aza potencial efeitos citotóxicos induzidos pelo agente alquilante, MNU, visto apresentar um aumento percentual de ADN na cauda dos cometas, em células tratadas com 5-Aza + BG + MNU comparativamente ao tratamento com BG + MNU. Isto demonstrou que o composto 5-AZA foi capaz de reverter a hipermetilação de hMLH1, tornando o sistema MMR funcional, aumentando os níveis de lesões O6MeG convertidas em SBs, detetadas pelo ensaio CoMeth. Foi demonstrado também que o 5-Aza inibe a expressão do gene DNMT1 levando ao restabelecimento de hMLH1, como verificado por qRT-PCR. Além disso, usando o ensaio CoMeth, foi possível observar que o tratamento com 5-Fluorouacil (5-FU) + 5-Aza, em termos clínicos poderá constituir uma nova estratégia terapêutica para reduzir a resistência tumoral ao agente quimioterapêutico 5-FU, visto que a reativação de hMLH1 faz com que as células cancerígenas fiquem mais sensíveis a este fármaco quimioterapêutico. Neste ensaio também foram testados alguns compostos naturais, verificando-se que (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) e Salvia officianalis (SO) induziram danos similares aos níveis do 5-Aza, sugerindo que esses compostos apresentam efeitos epigenéticos potenciais. Finalmente, verificou-se que o 5-Aza e SO não apresentam efeitos moduladores no sistema BER, dado que quando as células foram incubadas com 5-Aza/SO + BG + Mx + MNU, não se observou um aumento de danos no ADN. Como conclusão, no presente trabalho foi descrita uma nova aplicação do CoMeth, nomeadamente como ensaio que pode ser utilizado para testar potenciais compostos epigenéticos, sintéticos ou naturais, que revertam a hipermetilação de genes de reparação de ADN e consequentemente, contribuir para a melhoria da eficácia de fármacos quimioterapêuticos.

Colorectal cancer (CCR) is a health problem in Western society where it is the third most common cancer type. The study of the genetic patterns is not enough to define the human susceptibility to particular condition. CRC can arise from an accumulation of genetic and epigenetic alterations. Epigenetic is defined as the study of heritable changes in gene expression, without nucleotide sequence alterations and the epigenetic mechanism most explored is ADN methylation in promoter regions. The CpG island methylator phenotype (CIMP) characterized present in some case of CRC is by silencing of tumor suppressor genes. The aberrant promoter methylation of MLH1 happen in approximately 80% of sporadic CRC. Contrarily to gene mutations, epigenetic silencing can be reactivated by molecules that act as epigenetic modifiers (for instance, 5-azacytidine - 5-Aza) through the inhibition ADN methyltransferase (DNMT) enzymes. In this study, we explored a new application of the CoMeth assay, developed by our group, with the aim to assess epigenetic effects on MLH1 expression. For that, a MMR-deficient cell line (RKO) was using, which hMLH1 is epigenetically silenced by promoter hypermethylation and consequently, will not present comets in response to MNU due to the lack of functional mismatch repair. Firstly, we confirmed that the 5-Aza potentiates the cytotoxic effects induced by the alkylating agent, MNU, since we found an increase of % ADN in tail in cells treated with 5-Aza + BG + MNU comparatively to BG + MNU treatment. This demonstrated that 5-Aza was able to revert the hMLH1 hypermethylation leading to a functional MMR system increasing the levels of O6MeG lesions converted into SBs, detectable by CoMeth assay. We further showed that 5-Aza inhibits DNMT1 gene expression leading to the re-expression of hMLH1, as verified by qRT-PCR. Also, through the CoMeth, we observed that the 5-Fluorouracil (5-FU) + 5-Aza treatment, in clinical terms, may be a new therapeutic strategy to reduce the tumor resistance to 5-FU chemotherapeutic drug since the hMLH1 reactivation became the cancer cells more sensitive. We also tested some natural compounds using this assay and found that (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and Salvia officinalis (SO) induced similar levels of ADN damage to 5-Aza, suggesting that these compounds could have potential epigenetics effects. Finally, in preliminar experiments,we found that the 5-Aza and SO may not have modulating effects on the BER system because when cells were incubated with 5-Aza/SO + BG + Mx + MNU we did not observe an increase of ADN damage. Altogether, our data describes a new application of the CoMeth which can be used to investigate the potential of synthetic or natural epigenetic modulators that reverse the hypermethylated status of ADN repair genes and consequently improve the efficacy of clinical chemotherapeutic drugs.