Metodologia para deteção e diferenciação entre a estirpe vacinal e estirpes selvagens de Salmonella spp. por RT-PCR

Abstract

A realização deste trabalho teve como principais objetivos o acompanhamento da rotina laboratorial do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária (INIAV, I.P.) e o desenvolvimento e implementação de nova uma metodologia por PCR em tempo real (RT-PCR) que permita a confirmação de Salmonella após execução da norma ISO 6579:1-2017, e a distinção entre a estirpe vacinal e as estirpes selvagens de Salmonella presentes em amostras provenientes de produção primária. A rotina laboratorial consistia a análise de amostras alimentares, ambientais e de produção primária, inseridas em diferentes atividades (e.g. Plano de Inspeção de Géneros Alimentícios, Plano Nacional de Controlo de Salmonella, Postos de Inspeção Fronteriços e Ensaios Interlaboratoriais). Todas as amostras foram analisadas tendo em conta os parâmetros microbiológicos estabelecidos para a pesquisa de Campylobacter spp., pesquisa de enterotoxinas estafilocóccicas, pesquisa de Escherichia coli STEC/VTEC, pesquisa e contagem de Listeria monocytogenes, contagem de Enterobacteriaceae e de microrganismos a 30°C e pesquisa de Salmonella spp. A vacinação contra Salmonella é uma medida importante no controlo de bandos de frangos, perus, galinhas poedeiras e reprodutoras. Por isso, é essencial detetar no menor tempo possível a presença desta bactéria e consequentemente o seu serotipo, permitindo saber qual a estirpe de Salmonella que está a infetar os bandos. Então, procedeu-se ao desenvolvimento de uma nova metodologia relativamente rápida (i.e., após duas horas), qualitativa (i.e., presença/ausência) para deteção e diferenciação de estirpes de Salmonella através de uma técnica por RT-PCR baseada na utilização de três sondas do tipo TaqMan, contendo uma delas bases de LNA, tornando-a mais específica para deteção do serotipo vacinal. As amostras alimentares são testadas diretamente da purificação de uma colónia em NA do meio XLD que irá para serotipificação. Caso haja fluorescência no canal HEX, significa que foi detetada a sequência do gene ttr, utilizado para testar a presença de Salmonella. No caso de amostras de produção primária, são retiradas cerca de 10 colónias do XLD para NA (i.e., se através do aspeto macroscópico se suspeitar que existem diferentes serotipos) e da placa de XLD que é analisada em Lisboa, para serotipificação, e é retirada uma colónia (já purificada) de modo a confirmar os resultados obtidos, na medida em que os testes de confirmação serológicos e biológicos são realizados a partir desta mesma colónia isolada. Aqui, espera-se que haja fluorescência no canal Cy5 (nhaA-V) que deteta o gene nhaA no caso de a estirpe ser vacinal. Se a estirpe for selvagem, não haverá curva de amplificação na corrida de RT-PCR visto existir uma sequência para estirpes selvagens que compete com os locais de ligação da sonda nhaA-V. Desta forma, e associando ao seguimento das primeiras fases da norma ISO 6579 é possível garantir o isolamento de Salmonella e a eliminação dos falsos positivos. A existência de um controlo interno de amplificação (IAC) que deteta a sequência do plasmídeo pUC19, através do canal ROX, fornece uma ferramenta importante para a indicação de falsos negativos, que possam ser causados por inibição da reação de PCR, provocada pelas diferentes matrizes, ou até por algum erro no funcionamento do termociclador. Assim, foi possível concluir que a nova metodologia permite detetar Salmonella spp., após isolamento em meio XLD através da ISO 6579, e diferenciar a estirpe vacinal das selvagens, uma vez que o aspeto macroscópico obtido apresenta diferenças (i.e., aspeto côncavo no caso da estirpe vacinal e aspeto convexo no caso de estirpes selvagens). Foi ainda possível verificar que o caldo MKTTn favorecia o crescimento da estirpe vacinal e permitia com maior facilidade a sua deteção.

This project’s main goals were to follow the Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária (National Institute for Agrarian and Veterinary Research - INIAV, I.P.) laboratory daily routine and the development and implementation of a new methodology in real-time PCR (RT-PCR) that allowed the confirmation of Salmonella after the execution of normative ISO 6579:1-2017, and the distinction between vaccine and wildtype strains of Salmonella present in primary production’s samples. Laboratory daily routine consisted in the analysis of food, environmental and primary production samples, inserted in different activities (e.g., Food Inspection Plan, Airport and Seaport frontier analytical Support, Salmonella National Surveillance Plan and samples of interlaboratory assays. Every sample was analyzed taking into account the microbiological parameters established for the detection of Campylobacter spp., detection of staphylococcal enterotoxins, detection of Escherichia.coli STEC/VTEC, detection and enumeration of Listeria monocytogenes, enumeration of Enterobacteriaceae and plate count technique of microorganisms at 30°C and detection of Salmonella spp.. The vaccination in poultry is an important measure in control of Salmonella in the broilers, turkeys, laying and breeding hens. That is why it is essential to detect as fast as possible the presence of this bacteria and consequently its serotype, allowing us to know which Salmonella’s strain is infecting the flocks. Then, we proceeded to the development of a relatively fast (i.e., after two hours of the PCR run) and qualitative (i.e., presence/absence) new methodology for the Salmonella strains detection and differentiation through RT-PCR technique based on the utilization of three TaqMan probes, one of them containing LNA bases, making it more specific for vaccine serotype detection. The food samples are directly tested from the purification of a colony in NA plate of the XLD medium which will go to the serotyping. In case of a fluorescence detection in the HEX channel, a sequence of the ttr gene was detected, which is used to detect the presence of Salmonella spp.. In case of primary production samples, 10 colonies from XLD medium are inoculated into NA plate (i.e., if there is a suspicion of the existence of different serotypes through the macroscopic appearance) and from the XLD plates which go to Lisbon, for serotyping a colony is purified so it can confirm the obtained results, in so far as the serological and biological confirmation tests are performed from this isolated colony. Here is expected to exist fluorescence in channel Cy5 (nhaA-V) which detects the nhaA gene in case of the vaccine serotype. There will be no amplification curve in the RT-PCR assay in case of wildtype strain since there is a sequence for wildtype strains that compete with specific probes of vaccine strain for similar binding sites during RT-PCR. Therefore, and associating to the follow-up of the ISO 6579 first stages it is possible to assure the Salmonella isolation and the detection of false positive results. The existence of an internal amplification control (IAC) that detects the pUC19 plasmid’s sequence, through the ROX channel, provides an important tool for the indication of false-negative results, that may be caused by the PCR reaction inhibition, caused by the different matrices, or even by an error in the thermocycle operation. Therefore, it was possible to conclude that the new methodology allows to detect Salmonella spp., after isolation in the XLD medium, following ISO 6579, and differentiate the vaccinal strains from the wildtype once since the obtained macroscopic appearance reveals differences, i.e., concave appearance in the vaccinal strain’s case and convex appearance in the wildtype strains. It was also possible to see that the MKTTn broth was the medium which favoured the vaccine strain growth and allowed a easier detection.