Interacções proteína-proteína entre pequenas proteínas de choque térmico e proteínas do lisado celular de D. melanogaster

Abstract

Os níveis de expressão das pequenas proteínas de choque térmico variam em resposta a vários indutores de stress, como temperaturas elevadas ou compostos tóxicos. Estas proteínas podem também desempenhar vários papéis in vivo, durante o desenvolvimento normal. Foram identificadas quatro pequenas proteínas de choque térmico em Drosophila melanogaster (Hsp22, Hsp23, Hsp26 e Hsp27), que partilham sequências homologas. Os seus níveis de expressão variam consoante os órgãos e o estágio de desenvolvimento, sendo que cada uma delas tem uma localização intracelular e um padrão de expressão específico. O presente trabalho pretende estudar duas destas proteínas: as Hsp27 e Hsp22. A primeira é expressa ao longo de todo o ciclo de vida, enquanto que a expressão da Hsp22 varia com o envelhecimento, mesmo na ausência de stress. A primeira etapa deste trabalho foi a expressão de Hsp22 e Hsp27 recombinantes (com uma cauda de seis histidinas) em sistemas bacterianos, seguida pela purificação das mesmas recorrendo a vários métodos cromatográficos (cromatografia de afinidade, com a resina Ni- NTA, e cromatografia de troca iónica). As proteínas purificadas foram incubadas com lisados celulares de Drosophila, e a mistura foi submetida a uma cromatografia de afinidade, com a resina Ni-NTA. As fracções eluidas, contendo Hsps e as proteínas que com elas interagiram, foram analisadas por electroforese bidimensional e espectrometria de massa (MALDI-TOF). As proteínas identificadas vêm confirmar o envolvimento das pequenas proteínas de choque térmico na manutenção da integridade celular.

The expression levels of small heat shock proteins change in response to various stressors including high temperatures and toxic compounds. They may also play distinct functional roles in vivo during normal development. Four small heat shock proteins have been identified in D. melanogaster (Hsp22, Hsp23, Hsp26 and Hsp27). They share high sequence homology and their expression patterns differ depending on the organs and developmental stage, each showing specificity of expression and intracellular localization. The present work is focused on two of these proteins: Hsp27 and Hsp22. The first is expressed throughout the life cycle, while Hsp22 expression is known to change with aging, even in the absence of stress. The first stage of this work was the expression of polyhistidine-tagged Drosophila Hsp27 and Hsp22 in bacterial systems and subsequent purification using chromatographic methods (Ni-NTA affinity chromatography and ion exchange chromatography). The purified proteins were incubated together with fly lysates, and this mixture was resolved in a Ni-NTA affinity chromatography column. Eluted fractions containing purified Hsps together with their interacting proteins were analysed by 2D PAGE gels and mass spectrometry (MALDI-TOF). Proteins thus identified support the involvement of small Hsps in the maintenance of cell integrity.