APP RERMS enriched matrix as an adhesion substrate for neuritic outgrowth

Abstract

Specific domains can determine protein structural functional relationships. For the Alzheimer’s Amyloid Precursor Protein (APP) several domains have been described, both in its intracellular and extracellular fragments. Many functions have been attributed to APP including an important role in cell adhesion and cell to cell recognition. This places APP at key biological responses, including synaptic transmission. To fulfil these functions, extracellular domains take on added significance. The APP extracellular domain RERMS is in fact a likely candidate to be involved in the aforementioned physiological processes. A multidisciplinary approach was employed to address the role of RERMS. The peptide RERMS was crosslinked to PEG (Polyethylene glycol) and the reaction validated by FTIR (Fourier transform infrared spectrometry). FTIR proved to be the most efficient at validating this reaction because it requires only a drop of sample, and it gives information about the reactions occurred in a mixture. The data obtained consist in an infrared spectra of the sample, where peaks positions give information about the structure of the molecules, and the intensity of peaks is related to the concentration of the molecules. Subsequently substrates of PEG impregnated with RERMS were prepared and SH-SY5Y (human neuroblastoma cell line) cells were plated and differentiated on the latter. Several morphological alterations were clearly evident. The RERMS peptide provoked cells to take on a flatter appearance and the cytoskeletal architecture changed, with the appearance of stress fibres, a clear indicator of actin reorganization. Given that focal adhesions play a key role in determining cellular structure the latter were directly investigated. Focal adhesion kinase (FAK) is one of the most highly expressed proteins in the CNS (central nervous system) during development. It has been described to be crucial for radial migration of neurons. FAK can be localized in growth cones and mediated the response to attractive and repulsive cues during migration. One of the mechanisms by which FAK becomes active is by auto phosphorylation at tyrosine 397. It became clearly evident that in the presence of the RERMS peptide pFAK staining at focal adhesions intensified and more focal adhesions became apparent. Furthermore speckled structures in the nucleus, putatively corresponding to increased expression activity, also increased with RERMS. Taken together these results indicate that the RERMS domain in APP plays a critical role in determining cellular physiological responses. Here is suggested a model by which RERMS domain is recognized by integrins and mediate intracellular responses involving FAK, talin, actin filaments and vinculin. This mechanism probably is responsible for mediating cell adhesion and neurite outgrowth on neurons.

Nas proteínas domínios específicos podem determinar as suas relações funcionais e estruturais. Na Proteína Precursora da Doença de Alzheimer (APP) já foram descritos vários domínios presentes em ambas as porções intra e extracelulares. Várias funções têm sido atribuídas à APP incluindo na adesão celular e no reconhecimento célula-célula. Isto coloca a APP em respostas biológicas chave como a transmissão sináptica. Tendo em conta estas funções, os domínios extracelulares merecem uma maior atenção. O domínio extracelular RERMS da APP é de facto um candidato provável para estar envolvidos nos processos fisiológicos acima referidos Para investigar o papel do RERMS foi utilizada uma abordagem multidisciplinar. O péptido RERMS ligado ao PEG (polietileno glicol) através de uma reação de crosslinking, validada por FTIR (Fourier transform infrared spectrometry). A FTIR provou ser a técnica mais eficiente para a validação desta reação porque apenas necessita de uma gota de amostra, e providencia informação acerca das reações ocorridas numa mistura. O resultado obtido consiste num espectro de radiação infravermelha da amostra, onde as posições dos picos dão informação acerca da estrutura das moléculas, e a intensidade dos picos está relacionada com a concentração das moléculas. Subsequentemente foram preparados substratos com PEG e RERMS, plaqueadas células SH-SY5Y (células de neuroblastoma humano) e induzida a sua diferenciação. Foram claramente evidentes várias alterações morfológicas. O péptido RERMS causou uma morfologia mais achatada e a arquitetura do citoesqueleto ficou alterada, com o aparecimento de fibras de stress, um indicador da reorganização da actina. Dadas as adesões focais desempenharem um papel chave na determinação da estrutura celular, foram investigadas diretamente. A Cinase de adesão focal (FAK) é uma das proteínas mais expressas no sistema nervoso central (CNS) durante o desenvolvimento. Esta proteína foi descrita como crucial para a migração radial dos neurónios. A FAK pode ser localizada nos cones de crescimento e medeia a resposta a sinais atrativos e repulsivos durante a migração. Um dos mecanismos através do qual a FAK fica ativa é a auto-fosforilação no resíduo tirosina 397. Tornou-se evidente que na presença do péptido RERMS houve um aumento da marcação da pFAK (FAK fosforilada) nas adesões focais e mais adesões se tornaram evidentes. Além disso também aumentaram as estruturas arredondadas de pFAK no núcleo na presença do RERMS. Estes resultados indicam que o domínio RERMS da APP tem um papel critico na determinação de respostas fisiológicas celulares. Aqui é sugerido um modelo onde o domínio RERMS da APP é reconhecido pelas integrinas e medeia desta forma respostas intracelulares que envolvem a FAK, a talina, a vinculina e filamentos de actina. Este mecanismo é uma provavelmente é responsável pela mediação da adesão celular e crescimento de neurites em neurónios.