Amyloid precursor protein Thr668 phosphodependent complexes

Abstract

Alzheimer’s disease has as one of its characteristic hallmarks, deposits of a toxic peptide Aβ, known as senile plaques (SP). The toxic peptide is produced via complex intracellular pathways and cleavage of the Alzheimer’s Amyloid Precursor Protein (APP). Several aspects are key to APP processing. Among them, the proteins that bind to APP and form different complexes, which are functionally relevant. Recent studies have shown that the phosphorylation state of APP itself is determinant with respect to the protein complexes formed. Thus the protein’s phosphorylation state ultimately determines its own fate, the rate of Aβ production and the formation of SPs. It is also noteworthy the patients with Swedish mutation produced 10 times more Aβ. The aim of this thesis is to consider the above mentioned factors, which modulate Aβ production in a unified perspective. That is, to consider how protein phosphorylation affects Aβ production, bearing in mind the phosphorylated state of the protein itself and the complexes that are formed. In order to address these questions, several biological tools have to be available. Hence this thesis set out to prepare the APP Swedish mutations (to produce 10 times more Aβ) on a cDNA which also expressed phosphorylation site mutations on APP Thr668. This was achieved and it was possible to demonstrate that the resulting mutations did in fact produce considerably higher levels of the toxic peptide. Preliminary immunocytochemistry studies allowed for assessment of cellular distribution of the mutants and PP1γ in SHSY5Y cells, and more studies are needed to assess the co-localization of the trimeric protein complex between the APP mutants. PP1γ and Fe65. Therefore additional studies could contribute to a better understanding of the way that Aβ production is influenced by protein complexes regulated by APP phosphorylation.

A Doença de Alzheimer tem como uma das suas características principais, os depósitos do péptido tóxico Aβ, conhecidos como placas senis (PS). O péptido tóxico é produzido por complexas vias intracelulares e clivagens da Proteína Precursora Amiloide (PPA). Vários aspetos são importantes para o processamento da PPA. Entre eles, as proteínas que se ligam à PPA e formam diferentes complexes que são funcionalmente relevantes. Estudos recentes demonstraram que o estado de fosforilação da própria PPA é determinante para a formação desses complexos. Portanto, o estado de fosforilação da PPA determina o seu próprio destino, o rácio de produção de Aβ e a formação de placas senis. É também digno de nota que pacientes com mutação Swedish produzem cerca de 10 vezes mais Aβ. O objetivo desta tese é considerar os fatores acima mencionados que modulam a produção de Aβ numa perspetiva única. Ou seja, considerar como a fosforilação da PPA afeta a produção de Aβ, tendo em conta o próprio estado fosforilado da proteína e os complexos proteicos que dai são formados. De modo a responder a essas questões, várias ferramentas biológicas tem que ser disponibilizadas. Consequentemente, esta tese propõem-se a preparar mutações Swedish na PPA (para produzir 10 vezes mais Aβ), a partir de cDNA da PPA que expressa mutações que imitam a fosforilação da Thr668. Este objetivo foi conseguido e foi possível demonstrar que as referidas mutações produziram níveis consideravelmente altos do péptido tóxico. Estudos preliminares de imunocitoquímica permitiram avaliar a distribuição celular dos mutantes produzidos, bem como da PP1γ em células SH-SY5Y, mas mais estudos são necessários para avaliar a co-localização do complexo proteico trimérico entre os mutantes da PPA, PP1γ e Fe65. Assim sendo, estudos adicionais poderão contribuir para um melhor conhecimento da maneira como a produção de Aβ é influenciada por complexos proteicos regulados pela fosforilação da PPA.