Desenvolvimento de um biossensor para um biomarcador do cancro da mama

Abstract

A presente dissertação apresenta o desenvolvimento de um dispositivo dedicado ao diagnóstico do cancro da mama em point-of-care e que foi construído com base na preparação de um novo material biomimético e sua incorporação em membranas poliméricas de poli(cloreto de vinilo), PVC, plastificado, para subsequente deteção potenciométrica. Foi considerado para este estudo o biomarcador de interesse clínico convencional no contexto do cancro da mama, o Breast Cancer Antigen (CA15-3). O desenho do novo material biossensor baseou-se na síntese de anticorpos plásticos por tecnologia de impressão molecular. O anticorpo plástico foi impresso por polimerização em volta da estrutura proteica do CA15-3, atuando este biomarcador como obstáculo ao crescimento da matriz polimérica. O polímero impresso foi obtido por eletropolimerização de pirrol, estabelecida na superfície de vidro condutor (com FTO) com base em voltametria cíclica, que compreendeu 40 ciclos entre -0,2 e 1,0 V. A mistura reacional utilizada continha monómero (pirrol, 5,0×10-3 mol/L) e proteína molde (CA15-3, 100U/mL), preparados em solução de tampão fosfato salino, com pH 7,2 e com 1% de etilenoglicol. O biomarcador foi removido da matriz polimérica por ação proteolítica da proteinase K. O material biomimético preparado foi aplicado na construção de sensores potenciométricos e testado relativamente à sua afinidade e seletividade de ligação à CA15-3, por avaliação do desempenho analítico dos elétrodos resultantes. Para este efeito, o material biomimético foi disperso em membranas de PVC plastificado, que continham ou não um aditivo iónico lipofílico, e aplicado em suporte condutor sólido. O desempenho analítico foi avaliado inicialmente em meio tampão e posteriormente em soro sintético. As melhores características de resposta analítica em soro sintético foram obtidas com membranas preparadas com material impresso e com aditivo aniónico lipofílico, tetrakis-4-(Clorofenil)borato. Os limites de deteção correspondentes foram, em média, 4,6 U/mL de CEA, para uma resposta linear a partir de 5,4 U/mL e uma sensibilidade catiónica igual a 60,6 mV/década. As análises de soro sintético dopado indicaram resultados exatos e precisos.

This thesis presents the development of a low cost sensor device for the diagnosis of breast cancer in point-of-care, made with new synthetic biomimetic materials that were incorporated in plasticized poly(vinyl chloride), PVC, membranes, for subsequent potentiometric detection. This concept was applied to target a conventional biomarker in breast cancer: Breast Cancer Antigen (CA15-3). The new biomimetic material was obtained by molecularly-imprinted technology. In this, a plastic antibody was obtained by polymerizing around the biomarker that acted as an obstacle to the growth of the polymeric matrix. The imprinted polymer was specifically synthesized by electropolymerization on FTO conductive glass, by using cyclic voltammetry, including 40 cycles within -0.2 and 1.0 V. The solution where the polymerization took place contained monomer (pyrrol, 5.0×10-3 mol/L) and protein template (CA15-3, 100U/mL), all prepared in phosphate buffer saline, with a pH of 7.2 and 1% of ethylene glycol. The biomarker was removed from the imprinted sites by proteolytic action of proteinase K. The biomimetic material was employed in the construction of potentiometric sensors and tested with regard to its affinity and selectivity for binding CA15-3, by checking the analytical performance of the obtained electrodes. For this purpose, the biomimetic material was dispersed in plasticized PVC membranes, including or not a lipophilic ionic additive, and applied on a solid conductive support of graphite. The analytical behavior was evaluated first in buffer and later in synthetic urine. The best analytical performance in buffer was obtained with membranes including biomimetic material and lipophilic anionic additive, tetrakis-4-(Chlorophenyl)borate. The average limits of detection were 4.6 U/mL of CEA, with a linear response down to 5.4 U/mL and a cationic slope of 60.6 mV/decade. The analysis of spiked serum samples showed accurate and precise results.