O stress do retículo na remodelação do perfil lipídico do macrófago

Abstract

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade nos países desenvolvidos. Na sua génese encontra-se frequentemente a aterosclerose, um processo inflamatório crónico de origem multifatorial caracterizado pela acumulação e oxidação de lipoproteínas e recrutamento de macrófagos para o subendotélio arterial. A progressão da patologia encontra-se intimamente ligada à disfunção e morte dos macrófagos após fagocitose de lipoproteínas oxidadas. Embora não totalmente conhecido sabe-se que este processo envolve o desenvolvimento de stress do reticulo e ativação dos vários ramos da unfolded protein response (UPR). Neste contexto definiram-se dois objetivos a serem desenvolvidos no presente trabalho. No primeiro pretendeu-se compreender a influência do stress do retículo no metabolismo lipídico de macrófagos e as suas possíveis relações com a progressão da aterosclerose. Para tal foi usada como modelo experimental a linha celular de macrófagos de murganho RAW 264.7 estimulada com os indutores de stress Tunicamicina e 7-Cetocolesterol. Através de uma abordagem lipidómica determinou-se o efeito do stress do retículo no perfil lipídico do macrófago e através de qPCR foi avaliado o seu efeito num painel de genes envolvidos no metabolismo lipídico. Sucintamente, verificou-se o aumento da percentagem relativa das classes de fosfolípidos PI, LPC, PS, CL e PG, sendo em contrapartida observada uma diminuição de PC, SM e PE, consistente para ambos os estímulos. Ao nível dos ácidos gordos, verificou-se a alteração no rácio de saturados/insaturados, com aumento relativo dos primeiros. A diminuição observada na percentagem de ácidos gordos insaturados, a qual sugere a oxidação dos mesmos, foi corroborada pelo aumento detetado na percentagem de hidroperóxidos lipídicos e pela formação de espécies reativas de oxigénio para ambos os estímulos. A análise do efeito do stress do retículo na transcrição de genes envolvidos no metabolismo lipídico mostrou existirem diferenças substanciais no perfil obtido para cada um dos estímulos usados. A segunda parte do trabalho prendeu-se no estudo da capacidade dos fosfolípidos oxidados em induzir stress do retículo endoplasmático. Para tal tratou-se as células RAW 264.7 com o fosfolípido 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PLPC) oxidado em condições de Fenton. No entanto os resultados preliminares alcançados não permitiram inferir conclusões no que respeita à capacidade do fosfolípido PLPC oxidado em ativar os diversos ramos da UPR.

Cardiovascular diseases are the main cause of mortality in developed countries. In its origin is often atherosclerosis, a multifactorial inflammatory process characterized by the accumulation and oxidation of lipoproteins and recruitment of macrophages to the endothelium space. The progression of the pathology is intimately linked to dysfunction and dead of macrophages after phagocytosis of oxidized lipoproteins. Although not fully disclosed, this process evolves the development of endoplasmic reticulum stress and activation of the diverse branches of the unfolded protein response (UPR). In this context we established two main objectives for the present work. In the first we intended to understand the influence of endoplasmic reticulum stress in the lipid metabolism of macrophages and its possible relations to atherosclerosis progression. For this, murine macrophage cellular line RAW 264.7 stimulated with the stress inductors Tunicamycin and 7-Ketocholesterol was used as experimental model. Through a lipidomic approach it was determined the effect of reticulum stress on macrophage lipid profile and by qPCR it was estimated the effect in a panel of genes related with lipid metabolism. Briefly, it was observed an increase in the relative percentage of PI, LPC PS, CL and PG, phospholipid classes, while PC, SM and PE were decreased, consistent for both stimulus. In fatty acids analysis, we observed an alteration in saturated/unsaturated ratio, being the first only slightly increased. The observed decrease in the percentage of unsaturated fatty acids suggested their oxidation, and this hypothesis was supported by an observed increase of lipid hydroperoxide percentage and reactive oxygen species formation for both stimulus. The analysis of the effect of endoplasmic reticulum stress in the transcription of genes related with lipid metabolism showed substantial differences in the profile obtained for each stimulus used. The second part of the work it was based in the study of the ability of oxidized phospholipids to induce stress in endoplasmic reticulum. RAW 264.7 cells were treated with the phospholipid 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (PLPC) oxidized under Fenton reaction. Nevertheless the preliminary results do not allowed to conclude about the ability of oxidized PLPC in activating the diverse branches of UPR.