Cinética da apoptose induzida pelo vírus Influenza A

Abstract

A gripe é uma infeção respiratória, com elevada importância na saúde pública, provocada pelo vírus Influenza. Estima-se que anualmente as epidemias causem 35 milhões de casos graves de gripe e 250-500 mil mortes mundialmente. Os vírus influenza A estão associados a uma elevada capacidade evolutiva. Diversos estudos sugerem que o vírus evoluiu no sentido de equilibrar os processos apoptóticos durante a infeção, com base na presença de proteínas virais que desempenham funções anti e/ou pró-apoptóticos. A apoptose é um mecanismo celular que, quando ativado leva à morte celular de uma forma controlada e pode estar associado à defesa da célula como resposta a uma infeção viral. Neste contexto, definiu-se como objetivo principal deste projeto, analisar quantitativamente a cinética da morte celular total e da apoptose em infeções por vírus Influenza A de dois subtipos diferentes (A(H3N2) e A(H1N1)pdm09). Com o intuito de cumprir os objetivos propostos, no decurso deste trabalho foram constituídos stocks das estirpes virais através do isolamento e propagação das diferentes estirpes de vírus Influenza em células MDCK-SIAT1. A cinética da morte celular total e da apoptose foi avaliada através da infeção in vitro, do mesmo tipo de células, com a finalidade de analisar e quantificar, no período pós-infeção, a morte celular total e a apoptose, através de ensaios de citotoxicidade (técnica de LDH - lactato desidrogenase) e pela coloração de Hoescht, respetivamente. Com este estudo observou-se (1) a inibição da morte celular na fase inicial da infeção (primeiras 24-32 hpi) nos dois subtipos estudados e (2) diferenças na morte celular induzida pelo subtipo A(H1N1)pdm09 e A(H3N2) na fase tardia da infeção. Nomeadamente, em A(H1N1)pdm09 observa-se morte celular maioritariamente pela via apoptótica, contrariamente ao registado em A(H3N2). Até à data este é o primeiro estudo em que se avalia as diferenças na cinética da apoptose entre os vírus Influenza A dos subtipos A(H3N2) e A(H1N1)pdm09. O desenvolvimento desta área de trabalho pode contribuir para o conhecimento da cinética da apoptose como um dos mecanismos base do sucesso replicativo dos vírus Influenza que se poderá refletir nas diferenças de virulência e patogenicidade encontrada nos vários tipos e subtipos. Este modelo de estudo poderá, ainda, contribuir para a investigação de novos alvos antivirais assim como para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo do vírus Influenza.

The flu is a respiratory infection, with high public health importance, caused by the Influenza virus. It is estimated this epidemics cause, annually, 35 million cases of severe influenza and 250-500 thousand deaths worldwide. Influenza A virus are associated with a high ability to evolve. Several studies suggest that the virus has evolved in order to balance apoptotic processes during infection based on the presence of viral proteins that play anti and/or pro-apoptotic functions. Apoptosis is a cellular mechanism which, when activated, leads to cell death in a controlled manner and can be associated with the defense of the cell in response to a viral infection. In this context, it was defined as the main objective of this project, to quantitatively analyze the kinetics of total cell death and apoptosis in Influenza A virus infections by two different subtypes, (A(H3N2) and A(H1N1) pdm09). Aiming to fulfill the proposed objectives, in the course of this work, stocks of viral strains were established by isolation and propagation of different strains of influenza virus in MDCK-SIAT1 cells. The kinetics of total cell death and apoptosis was evaluated by in vitro infection of the same cell line. In order to analyze and quantify the post-infection period, total cell death and apoptosis was assed using cytotoxicity assays (Technical LDH - lactate dehydrogenase) and Hoechst staining, respectively. In this study, it was observed (1) a inhibition of cell death in early stage of infection (within the first 24-32 hpi) in both subtypes studied and (2) differences in cell death induced by subtype A(H1N1)pdm09 and A(H3N2) in the late phase of infection. Namely, in subtype A(H1N1)pdm09 it is observed cell death by the apoptotic pathway, contrary to that for subtype A(H3N2). So far, this is the first study that assesses differences in the kinetics of apoptosis among Influenza A virus subtypes A(H3N2) and A(H1N1)pdm09. The development of this area of work can contribute to the knowledge of the kinetics of apoptosis as one of the basic mechanisms of replicative success of influenza viruses that may reflect differences in virulence and pathogenicity found in many types and subtypes. This study model may also contribute to the research of new antiviral targets as well as for the development of new strategies for control of Influenza virus.