Structure-function relationship of immunostimulatory polysaccharides

Abstract

Coffee polysaccharides, namely the arabinogalactans present in instant coffee and the galactomannans of coffee infusions have in vitro immunostimulatory activity, shown by an inflammatory response. Previous works showed that an instant coffee extract with 1–5 kDa (sample 1E), obtained by ultrafiltration, resultant from an exhaustive washing out of the small molecular weight compounds, presented in vitro immunostimulatory activity. However, another similar extract (sample 2E), this time resultant from a rudimentary fractionation, had no activity. Based on the hypothesis that small molecular weight compounds may interfere on the in vitro immunostimulatory activity of these polysaccharides, in this study, sample 2E was purified through Bio-Gel P2 size exclusion chromatography (SEC-P2) and the in vitro immunostimulatory activity in BALB/c mice spleen B and T lymphocyte cells was studied by the expression of an early activation marker (CD69). Results allowed concluding that the presence of small molecular weight compounds, namely chlorogenic acids (CGA) and caffeine, interfere with the determination of the in vitro immunostimulatory activity of coffee polysaccharides. Aiming to know what could be the structural characteristics responsible for the instant coffee arabinogalactans potential immunostimulatory activity, sample 1E was also fractionated by size-exclusion chromatography using Bio-gel P6 (1-6 kDa). Three fractions were pooled and freeze-dried and their immunostimulatory activity was evaluated, allowing to observe that the immunostimulatory activity of sample 1E derived from the fraction with a molecular weight near 5 kDa. The treatment of sample 1E with 0.1 M NaOH solution decreased by 58.2 % the in vitro activation of B lymphocytes. Although FTIR analyses of the saponified and dialysed sample 1E showed an increase of the presence of carboxylic acids when compared to the native sample, but no difference in the amount of acetyl groups were detected by gas chromatography of the head-space solid-phase microextraction (HS-SPME-GC-FID). Also, similar carbohydrate composition was observed by GC-FID for the sample before and after saponification. To disclose the possibility that, upon saponification, the CGA could have been released from melanoidin structures and be adsorbed to the polysaccharides, even upon exhaustive dialysis, a SEC-P2 was performed. As the chromatogram obtained did not show absorbances at 280 and 325 nm in the inclusion volume, it was possible to infer that the loss of immunostimulatory activity was not due to the presence of adsorbed CGA. Sample 1E had 5.5% of total protein. In order to evaluate the influence of the presence of protein for the immunostimulatory activity, sample 1E was treated with chymotrypsin. The resulted deproteinised sample (1Edep) had a similar carbohydrate composition and the same immunostimulatory activity. The treatment with an α-L-arabinofuranosidase, which should remove terminally-linked arabinose residues, allowed, after purification through SEC-P2, to observe that the sample lost the in vitro immunostimulatory activity to stimulate B and T lymphocytes.In order to obtain more information on how sample 1E can activate the B and T lymphocytes, the sample 1E was tested in innate immune macrophages (BMDM) and dendritic cells (BM-DCs) derived from bone-marrow. The results showed the production of NO by BMDM and the increase of the expression of surface activation markers MHC-II, CD80, and CD86 by BM-DCs, indicating the activation of both cell types. It is possible that the activation of macrophages and dendritic cells may be involved in the activation of B and T spleen lymphocytes by sample 1E. The results obtained allowed to conclude that the in vitro immunostimulatory activity of instant coffee arabinogalactan-rich fractions results from a fraction near 5 kDa. This activity seems to be dependent of the presence of arabinose terminally-linked residues but not on the acetylation of the polysaccharide neither on the protein content. Also, it was possible to conclude that the in vitro immunostimulatory activity of these fractions is negatively influenced by the presence of CGA and caffeine. Although these compounds interfere in in vitro experiments, it is not expected that they could interfere in vivo because during digestion the low molecular weight compounds are absorbed in the upper small intestine whereas the polysaccharides and melanoidins are not. Along the digestive tract, the immunostimulatory effect of polysaccharides should prevail when interacting with immune cells found in Peyer's patches or with dendritic cells found in the small-intestinal lamina propria, before colon fermentation.

Os polissacarídeos do café, nomeadamente as arabinogalactanas do café instantâneo e as galactomananas da infusão de café, têm atividade imunoestimuladora in vitro, verificada através de uma resposta inflamatória. Os estudos anteriores mostraram que um extrato de café instantâneo com 1-5 kDa (amostra 1E), obtido por ultrafiltração, com lavagem exaustiva dos compostos de baixo peso molecular, apresentou atividade imunoestimuladora in vitro. No entanto, um extrato semelhante (amostra 2E), desta vez resultante de um fracionamento rudimentar, não tinha atividade. Com base na hipótese de que os compostos de baixo peso molecular podem interferir na atividade imunoestimuladora in vitro destes polissacarídeos, neste estudo, a amostra 2E foi purificada por cromatografia de exclusão molecular em Bio-Gel P2 (SEC-P2) e a atividade imunoestimuladora in vitro foi estudada em linfócitos B e T de células esplénicas de ratinhos BALB/c por expressão de um marcador precoce de ativação (CD69). Os resultados obtidos permitiram concluir que a presença de compostos de baixo peso molecular, nomeadamente ácidos clorogénicos (CGA) e cafeína, interferem com a determinação da atividade imunoestimuladora in vitro dos polissacarídeos do café. Com o objetivo de saber quais as características estruturais responsáveis pela potencial atividade imunoestimuladora das arabinogalactanas do café instantâneo, a amostra 1E foi também fracionada por cromatografia de exclusão molecular em Bio-Gel P6 (1-6 kDa). Três frações foram recolhidas e liofilizadas e a sua atividade imunoestimuladora foi avaliada, permitindo observar que a atividade imunoestimuladora da amostra 1E deriva da fração com um peso molecular próximo de 5 kDa. O tratamento da amostra 1E com uma solução de 0,1 M de NaOH diminuiu 58,2% a ativação in vitro de linfócitos B. Embora as análises de FTIR da amostra 1E saponificada e dialisada tenham mostrado um aumento da presença de ácidos carboxílicos quando comparado com a amostra nativa, não foram verificadas diferenças na quantidade de grupos acetilo, avaliadas por micro-extração em fase sólida da fase de vapor e análise por cromatografia em fase gasosa e detetor de ionização de chama (HS-SPME-GC-FID). A análise de GC-FID permitiu também observar uma composição de açúcares semelhante antes e após saponificação. Para testar a possibilidade de, após a saponificação, os CGA poderem ter sido libertados das estruturas das melanoidinas e ficarem adsorvidos aos polissacarídeos, mesmo após diálise exaustiva, foi realizada uma separação por SEC-P2. Uma vez que o cromatograma obtido não mostrou absorvâncias a 280 e 325 nm no volume de inclusão, foi possível deduzir que a perda de atividade imunoestimuladora não foi devida à presença de CGA adsorvidos. A amostra 1E tinha 5,5% da proteína total. De forma a avaliar a influência da presença de proteína para a atividade imunoestimuladora, a amostra 1E foi tratada com quimotripsina. A amostra desproteinizada resultante (1Edep) tinha uma composição de açúcares semelhante e a mesma atividade imunoestimuladora. O tratamento com uma α-L-arabinofuranosidase, que remove os resíduos de arabinose em ligação terminal, permitiu, após purificação através de SEC-P2, observar que a amostra perdeu a atividade imunoestimuladora in vitro de linfócitos B e T.Para aprofundar o conhecimento sobe o modo de ativação dos linfócitos B e T pela amostra 1E, esta amostra foi testada em macrófagos (BMDM) e células dendríticas (BM-DCs) da imunidade inata, derivadas da medula óssea. Os resultados mostraram a produção de NO pelos BMDM e o aumento da expressão de marcadores de superfície de ativação, MHC-II, CD80 e CD86, pelas BM-DCs, indicando a ativação de ambos os tipos de células. Estes resultados mostram que é possível que a ativação de macrófagos e de células dendríticas possa estar envolvida na ativação dos linfócitos B e T do baço pela amostra 1E. Os resultados obtidos também permitiram concluir que a atividade imunoestimuladora in vitro das frações de café instantâneo ricas em arabinogalactanas resulta de uma fração com cerca de 5 kDa. Esta atividade parece ser dependente da presença de resíduos de arabinose em ligação terminal e não da extensão da acetilação do polissacarídeo nem do conteúdo proteico presente. Foi também possível concluir que a atividade imunoestimuladora in vitro destas frações é influenciada negativamente pelos CGA e cafeína, caso estejam presentes. Embora estes compostos interfiram em experiências in vitro, não é de esperar que possam interferir in vivo porque durante a digestão os compostos de baixo peso molecular são absorvidos na parte superior do intestino delgado, enquanto os polissacarídeos e as melanoidinas não o são. Ao longo do trato digestivo, o efeito imunoestimulador dos polissacarídeos deve prevalecer ao interagir com as células do sistema imunitário encontradas nas placas de Peyer ou com as células dendríticas encontradas na lâmina própria do intestino delgado, antes da fermentação no cólon.