Descoberta de novas suberinases através de uma abordagem metagenómica

Abstract

A espécie de formigas, Crematogaster scutellaris, nidifica na cortiça de sobreiros (Quercus suber L.), escavando galerias extensas que diminuem o valor comercial deste produto. Acredita-se que a degradação da cortiça é efetuada por enzimas digestivas secretadas pelas glândulas da própria formiga, como também por microrganismos simbiontes presentes no seu sistema digestivo intestinal – o microbioma intestinal. Tendo em conta que a cortiça é composta maioritariamente por suberina, o objetivo principal deste trabalho foi a pesquisa de genes do microbioma intestinal que codificam suberinases (cutinases, feruloil esterases e lacases). Para tal, estabeleceu-se uma estratégia de amplificação dos genes das enzimas alvo e respetiva sequenciação e anotação funcional. Na primeira fase efetuou-se o estudo da composição taxonómica do microbioma intestinal. O DNA total da comunidade microbiana presente no intestino e estômago das formigas (metagenoma) foi extraído e as sequências correspondentes aos genes do rRNA 16S amplificadas por PCR e pirosequenciadas. Da comunidade bacteriana destaca-se a predominância do filo Proteobacteria com 68,0% do número total de sequências, seguindo-se os filos Bacteroidetes (17,2%), Firmicutes (7,0%), Acidobacteria (4,6%) e Actinobacteria (3,2%). Os taxa identificados foram pesquisados na literatura para a presença de genes de cutinases, feruloil esterases e lacases. Numa segunda fase, recorrendo a bases de dados e ferramentas bioinformáticas, procedeu-se ao desenho de primers “consenso” para zonas conservadas de cutinases, feruloil esterases e lacases e as enzimas alvo foram amplificadas a partir do DNA do microbioma intestinal. As enzimas foram posteriormente pirosequenciadas para identificação e anotação funcional. A estratégia funcionou bem para as lacases, no entanto não foi possível identificar sequências para as restantes enzimas alvo (cutinases e feruloil esterases). A anotação funcional das sequências obtidas identificou 4 lacases bacterianas pertencentes à família multi-cobre oxidase, sendo 3 anotadas como proteína A de resistência ao cobre e uma como precursor da oxidase CueO. Os genes apresentaram elevada homologia com lacases dos géneros Rhodococcus, Serratia e Tetrasphaera, sugerindo que se trate de novas enzimas com capacidade de oxidação de compostos fenólicos presentes na lenhina da cortiça. Apesar dos resultados animadores, são necessários estudos subsequentes para desvendar a totalidade dos genes codificantes de lacases, e comprovar a sua especificidade e actividade enzimáticas em vários substratos fenólicos.

The ant species, Crematogaster scutellaris, nests in the bark of cork oak (Quercus suber L.), digging extensive galleries that decrease the commercial value of this product. It is believed that cork degradation is carried out by digestive enzymes secreted from the glands of the host (ant), as well as by symbiotic microorganisms present in their intestinal digestive system – the gut microbiome. Given that cork is composed mostly by suberin, the main objective of this work was the targeted-gene search in the gut microbiome for encoded suberinases (cutinases, feruloyl esterases and laccases). To do so, a strategy for enzyme gene amplification and respective sequencing and functional characterization was established. First, a study of the taxonomic composition of the gut microbiome was carried out. The total DNA of the microbial community present in the intestine and stomach of ants (metagenome) was extracted and the sequences corresponding to the 16S rRNA genes amplified by PCR and pyrosequenced. In the bacterial community stands out the predominance of the phylum Proteobacteria with 68,0% of the total number of sequences, followed by the phyla Bacteroidetes (17,2%), Firmicutes (7,0%), Acidobacteria (4,6%) and Actinobacteria (3,2%). The taxa identified were surveyed in literature for the presence of the target genes. In a second stage, consense primers for conserved regions of cutinases, feruloyl esterases and laccases were built based on database information and bioinformatics tools and the targeted enzymes amplified from the DNA of the intestinal microbiome. The enzymes were subsequently pyrosequenced for identification and functional annotation. The strategy established was successful for laccases, however it was not possible to identify sequences for the other targeted enzymes (cutinases and feruloyl esterases). Functional annotation of sequences identified four bacterial laccase sequences belonging to the multi-copper oxidase family, three of them annotated as "copper resistance protein A" and one as "blue copper oxidase CueO precursor." The sequences had high similarity with those of the genus Rhodococcus, Serratia and Tetrasphaera, and appear to be new enzymes capable of oxidizing phenolic compounds present in the lignin of cork. Inspite of the encouraging results, further studies are needed to unravel the complete genes that encode laccases and verify its enzymatic activity and specificity in a broad range of phenolic compounds.