Descoberta de marcadores de patogenicidade em B. xylophilus

Abstract

Bursaphelenchus xylophilus, o nemátode-da-madeira-do-pinheiro, é o agente causador da doença da murchidão do pinheiro e é considerado uma das mais perigosas pestes para os ecossistemas onde foi introduzido. A biologia e ecologia do nemátode que estão estritamente associadas à indução da doença têm sido extensivamente estudadas. No entanto, as interações desencadeadas entre as plantas e os nemátodes durante o desenvolvimento da doença da murchidão do pinheiro continuam por esclarecer. Para elucidar esta interacção utilizou-se uma abordagem de transcritómica comparativa. O transcritoma de B. xylophilus foi comparado com o de B. mucronatus, um nemátode filogeneticamente próximo e incapaz de induzir murchidão em pinheiros, Adicionalmente, foram comparados entre si, os transcritomas de B. xylophilus machos, fêmeas e JIII, isolados de pinheiro, assim como estes três transcritomas contra o de B. xylophilus crescido em fungo. Diversas estratégias de transcritómica comparativa e diferentes ferramentas bioinformáticas foram integradas, permitindo a identificação de 28 genes cuja expressão relativa foi quantificada entre as amostras em estudo por RT-PCR. Todos os genes analisados apresentam níveis de expressão significativamente diferentes entre as amostras, com prevalência na comparação entre nemátodes crescidos em fungo e planta. As estratégias utilizadas identificaram o metabolismo do homogentisato como diferencialmente ativo entre as amostras. O envolvimento deste composto no combate ao stress oxidativo sugere a sua potencial ação no mecanismo de parasitismo do nemátode. Esta é a primeira evidência da ativação deste mecanismo em B. xylophilus, com especial interesse na sua ativação em planta durante o parasitismo. Genes de fosfatases ácido roxas, catepina L e cistatina 5 apresentaram os maiores níveis de expressão em nemátodes crescidos em planta face a fungo, apresentando sobre-expressões de 200, 110 e 16 vezes superiores, respetivamente. As fosfatases ácido roxas são potencialmente secretadas e podem estar envolvidas na produção de espécies reativas de oxigénio. A catepsina L pode promover uma interação direta entre o nemátode e o pinheiro, sendo um alvo já estudado para controlo de nemátodes parasitas de plantas. A cistatina 5 tem sido associada a um mecanismo de fuga ao sistema de reconhecimento de hospedeiros em nemátodes parasitas. Outros genes foram identificados neste estudo como o da trealase, uma enzima que actua sobre trealose, um polissacarídeo associado à destoxificação oxidativa em nemátodes. Várias proteínas envolvidas no proteossoma celular, nomeadamente na garantia da produção de enzimas funcionais, foram também evidenciadas. A ativação deste processo poderá permitir uma ação mais rápida na resposta do nemátode a estímulos externos como os encontrados dentro do pinheiro. A análise experimental futura dos genes estudados evidenciará processos relevantes na biologia e no parasitismo do nemátode e poderá revelar a potencialidade de utilização de alguns deles no controlo do nemátode.

Bursaphelenchus xylophilus, known as the pinewood nematode, is the causative agent of pine wilt disease and is considered one of the most dangerous pests to worldwide ecosystems where it was introduced. Pinewood nematode biology and ecology that are strictly associated to disease induction have been extensively investigated. However, plant-nematode interactions triggered during pine wilt disease development remain unclear. A comparative transcriptomics approach was used to elucidate this interaction. B. xylophilus transcriptome was compared to transcriptome of B. mucronatus, which is a phylogenetically close nematode of B. xylophilus and unable of wilting in pine trees. Additionally, the transcriptomes of B. xylophilus males, females and JIII isolated from pine trees were compared among them and against B. xylophilus grown on fungi. Several strategies of comparative transcriptomics and different bioinformatics tools were integrated allowing the identification of 28 genes. Their relative expression was measured in all samples under study by RT-qPCR. All analyzed genes presented levels of expression significantly different, with special attention on the comparison of nematodes grown in fungi and plant. The strategies used identified homogentisate metabolism as differentially activated between samples. The role of homogentisate in oxidative stress detoxification suggests their potential action in the parasitism mechanism of nematode. This is the first evidence of the activation of homogentisate mechanism in B. xylophilus, including their presence during parasitism. Genes of purple acid phosphatases, cathepsin L and cystatin 5 presented the highest expression levels in nematodes grown on pine comparing to those grown on fungi. Their expression levels were of about 200, 110 and 16 times, respectively. Purple acid phosphatases are probably secreted and are involved in reactive oxygen species production. Cathepsin L may promote a direct interaction between the nematode and pine, being a target already studied for plant parasitic nematodes control. Cystatin 5 has been associated with a host recognition of parasitic nematodes escape mechanism. Other genes were identified in this study, such as trehalase, the enzyme that cleaves trehalose. This polysaccharide is involved in nematode oxidative detoxification. Several proteins involved in the production of cellular proteasome, particularly in ensuring the production of functional enzymes were also evidenced. Activation of this process may allow a faster response to external stimuli such as those occurring inside the pine tree. The future experimental analysis genes identified will elucidate relevant processes in B. xylophilus biology and parasistism. Some of these genes may become useful for nematode control.