Sinalização celular e a resposta a estrogénios do epitélio mamário

Abstract

Estrogens, such as 17β-estradiol (E2) are essential for normal growth and differentiation of the mammary gland. There are two estrogen receptors (ERs), ERα and ERβ which are ligand activated transcription factors. ERα stimulates proliferation and is the single most powerful predictor of breast cancer prognosis and since 70% of breast cancers express ERα, strategies to block this receptor are the primary breast cancer treatment. Unlike ERα, the role of ERβ in breast cancer and its potential as alternative therapeutic target remains controversial, mainly due to the lack of correlation between results obtained in vitro and epidemiological studies. The aim of this thesis was to increase our understanding of the molecular and cellular mechanisms of estrogen signaling in normal and cancerous cells, in different cellular contexts and with focus on ERβ. In Paper I we characterized the effect of the flavone PD098059 - which is a commonly used MEK1 inhibitor - on activation of transcription by ERα and ERβ. We found that the estrogenic effect of PD098059 is dose dependent in concentrations ranging from 1 – 10 μM and that activation of transcription by ER is suppressed by the inhibitory effect of PD98059 on MEK1 at concentrations above 50 μM. In agreement with its flavone nature, PD098059 had a much stronger effect on ERβ than on ERα transcriptional activity. Therefore, use of this compound for the study of signalling events in cells expressing ER should be carefully considered. In Paper II we assessed the effect of ERβ agonists in vivo and administered under different conditions in vitro. In basal conditions, ERβ induced apoptosis; however, in vivo ERβ agonists stimulated proliferation and inhibited apoptosis. In vivo effects were reproduced in culture, by activation of MAPK/ERK½ pathway with epidermal growth factor or basement membrane extract. In addition, insulin signalling and PI3-K/AKT activation was necessary for stimulation of proliferation. These results suggest that the cellular context modulates ERβ activity. Manuscript presents preliminary work aimed at the set-up of a methodological strategy to isolate ERs and to identify interacting proteins in different cellular contexts and which could modulate the bi-phased effects of ERβ in cell growth. In conclusion, the studies presented in this thesis contribute to clarify the apparent contradictory information regarding ERβ function in normal and cancerous mammary epithelium and suggest that the cellular context should be considered when ERβ effects are studied.

Estrogénios como 17β-estradiol (E2) são essencial para o crescimento e desenvolvimento normal da glândula mamária. São conhecidos dois recetores de estrogénio (REs), REα e Reβ os quais são fatores de transcrição ativados por ligando. REα estimula a proliferação e é um marcador utilizado no prognóstico do cancro da mama. Uma vez que 70% dos tumores mamários são classificados por RE-positivos. Por conseguinte o tratamento anti-estrogénio é a uma das estratégia no tratamento deste tipo de tumores. Contrariamente a REα, a função de REβ e o seu potencial como alvo terapêutico é causa de controvérsia, uma vez que não há correlação entre os dados obtidos in vitro e os estudos epidemiológicos. O objetivo desta tese foi aumentar o conhecimento dos mecanismos moleculares e celulares da sinalização de E2 focado no REβ, em células normais e tumorais em diferentes contextos celulares. No artigo I nós caracterizamos o efeito de uma flavona PD098059, inibidor da MEK1, na transcrição de REα e REβ. Nós observamos que em concentrações entre 1 – 10 μM de PD098059, este possui um efeito estrogénico, e que a ativação transcricional de RE é bloqueada pelo efeito inibidor de PD098059 em MEK1, em concentrações superiores a 50 μM. De acordo com a sua natureza como flavona o PD098059 possui um efeito preferencial na atividade de REβ relativamente a REα. Com estes dados, concluímos que o uso deste composto para o estudo de sinalização celular na presença de RE, deve ser cautelosamente ponderado. No artigo II nós avaliamos o efeito do agonista de REβ in vivo e in vitro em diferentes condições. In vitro e em condições basais, o agonista de REβ induz a apoptose, contudo, in vivo estimulou a proliferação e houve uma redução da apoptose. Os efeitos in vivo foram reproduzidos in vitro pela ativação da via de sinalização da MAPK/ERK ½, com fator epitelial de crescimento ou extrato basement membrane. A ativação das vias de sinalização da insulina e da PI3-K/AKT são necessárias para estimular a proliferação. Estes resultados sugerem que o contesto celular tem um papel predominante na função de REβ. Manuscrito, os dados preliminares presentes neste trabalho, têm como objetivo a otimização de metodologia para isolar RE e identificar proteoma em diferentes contextos celulares. Estas proteínas podem influenciar o duplo efeito de REβ no crescimento celular. Em conclusão, os estudos presentes nesta tese contribuem para clarificar a aparente função contraditória de REβ no epitélio mamário tumoral e normal. Sugerem ainda que o contexto celular deveria ser considerado nos estudos dos efeitos de ERβ.