Interactor factors as suppressors of mutated mitochondrial tRNA

Abstract

Neste trabalho avaliou-se o efeito de mutações em tRNA mitocondrial humano usando a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo. Em termos genéricos S. cerevisiae é um microrganismo muito estudado e conhecido, sendo possível modificar o seu genoma de forma rápida e precisa. Como bom modelo permite estudar este tipo de doenças através da mutação dos seus genes que codificam para tRNAs através de um procedimento biobalístico. Com este procedimento é possível introduzir mutações nos genes que codificam para tRNAs mitocondriais da levedura em qualquer posição, incluindo mutações equivalentes às que são patogénicas em humanos. S. cerevisiae é também um bom modelo pois os seus mutantes que exibem deficiências respiratórias, complexas ou muitos graves, têm a capacidade de crescer pois continuam a realizar fermentação em glucose, permitindo assim efectuar estudos funcionais moleculares. Para além do referido, o uso de diferentes estirpes de S. cerevisiae com diferentes mutações permite estudar genes nucleares isolados capazes de suprimir o fenótipo anormal dos mutantes, neste caso o crescimento num meio respirável. Na primeira parte deste projecto caracterizaram-se três estirpes diferentes de S. cerevisiae wild-type, MCC123, D273-10B/1A e W303-1B e subsequentemente o efeito de substituições nos tRNAs mitocondriais com o propósito de definir uma relação entre a eficiência mitocondrial e a presença de diferentes contextos nucleares. Concluiu-se que as estirpes MCC123 e W303-1B são mais apropriadas para o estudo de mutações severas, em contraste a D273-10B/1A é mais adequada para estudar mutações mais leves. Na segunda parte estudou-se a actividade supressora da sobre-expressão dos genes que codificam para leucil-tRNA sintetase, o seu domínio C-terminal e algumas pequenas sequências em diferentes mutantes nos tRNAs incapazes de crescer em meios contendo glicerol (GlnC6T, AspC61T, GlyG30A e HisG51A). A tRNA sintetase inteira (genes de levedura e de humano) e o Cterminal têm alguma capacidade de suprimir o fenótipo anormal, mas o melhor resultado foi obtido sobre-expressando as sequências mais pequenas que codificam para péptidos de quinze aminoácidos do domínio C-terminal (β30-31 e β32-33). Outras sequências testadas não tiveram qualquer efeito supressivo. Também foi caracterizada a capacidade supressora dos factores de elongação da síntese proteica mitocondrial de levedura e humana em células carregando a mutação AspC61T. Os nossos resultados, sobre-expressando tRNA sintetases e factor EF-Tu, mostram que a capacidade catalítica não é necessária para a supressão e sugerimos que esteja envolvida uma catividade tipo chaperone.

In this work we evaluate the effect of mitochondrial tRNA mutations using the yeast Saccharomyces cerevisiae as model. This simple organism is good model since it is possible to transform the mitochondria by a biolistic procedure. This makes possible to introduce mutations at any desired position in yeast mt tRNA genes, including mutations equivalent to those that are pathogenic in humans. Yeast offers a unique possibility in that mutants exhibiting complete or very severe respiratory deficiencies can grow by fermentative metabolism on glucose and are therefore amenable to molecular functional studies. Moreover using the yeast strains with the different mutations is possible to isolate nuclear genes able to suppress the defective phenotype of the mutants, in this case to allow the growth on respirable medium (containing glycerol as unique carbon source). In the first part of this project we characterized three different S. cerevisiae wild-type strains, MCC123, D273-10B/A1 and W303-1B and subsequently the effect of mt tRNA substitutions in order to define a relationship between the mitochondrial efficiency and the presence of different nuclear backgrounds. We concluded that MCC123 and W303-1B are more appropriate to study severe mutations whereas the D273-10B/A1 is more suitable to study milder mutations. In the second part of ours experiments we studied the suppression activity overexpressing the mt leucyl-tRNA synthetases genes, it C-terminal domain and some shorter sequences in different tRNA mutants unable to grow in glycerol containing media (GlnC6T, AspC61T, GlyG30A and HisG51A). The entire tRNA synthetases (yeast and human genes) and the C-terminal have some capability of suppress the defective phenotype, but the best result was obtained overexpressing two shorter sequences coding for fifteen aminoacids from its C-terminal domain (β30-31 and β32-33). Other sequences tested did not have any supress effect. I also report a further characterization of the functionality of mt yeast and human mt protein synthesis elongation factors in their suppressing activities in cells bearing the AspC61T mutation. Our results, overexpressing either the tRNA synthetases or the EF-Tu factor, show that the catalytic function is not necessary for suppression and we suggest that a chaperone like activity is involved.