Digital imaging processing tools for neuronal images

Abstract

Os neurónios são celulas especializadas do Sistema Nervoso, cujas funções se baseiam na correta formação de três compartimentos subcelulares primários – corpo celular, axónio e dendrites – e na rede neuronal que formam para passar a informação entre si. A análise quantitativa das características destas estruturas pode ser usada para estudar a relação entre a morfologia e função neuronal, e monitorizar alterações que ocorram em células individuais ou ao nível da rede, que se possam correlacionar com doenças neurológicas. Nesta tese foi efetuada uma pesquisa de ferramentas digitais disponíveis dedicadas ao processamento e análise de imagens neuronais, com enfoque na sua aplicabilidade para analisar as nossas bioimagens neuronais de fluorescência adquiridas no dia-a-dia. Nos programas selecionados (NeuronJ, NeurphologyJ e NeuriteQuant) foi primeiro avaliada a necessidade de preprocessamento, e os programas foram subsequentemente utilizados em conjuntos de imagens de culturas primárias de córtex de rato para comparar a sua eficácia no processamento destas bioimagens. Os dados obtidos com os vários programas foram comparados com a análise manual usando o ImageJ como ferramenta de análise. Os resultados demonstraram que o programa que aparenta funcionar melhor com as nossas imagens de fluorescência é o NeuriteQuant, porque é automático e dá resultados globalmente semelhantes aos da análise manual, especialmente na avaliação do Comprimento das Neurites por célula. Uma das desvantagens é que a quantificação da ramificação das neurites não dá resultados satisfatórios e deve continuar a ser realizada manualmente. Também realizamos uma pesquisa de ferramentas de processamento de imagem dedicada a imagens de contraste de fase, mas poucos programas foram encontrados. Estas imagens são mais fáceis de obter e mais acessíveis economicamente, contudo são mais difíceis de analisar devido às suas características intrínsecas. Para contornar esta lacuna, estabeleceu-se e otimizou-se uma sequência de processamento e análise para melhor extrair informação neuronal relevante de imagens de contraste de fase utilizando o programa ImageJ. A sequência desenvolvida, na forma de uma macro do ImageJ designada NeuroNet, foi aplicada a imagens de contraste de fase de culturas neuronais em diferentes dias de diferenciação, na presença ou ausência de um inibidor farmacológico, com o objetivo de responder a uma questão científica. A macro NeuroNet desenvolvida provou ser útil para analisar estas bioimagens, existindo contudo espaço para ser aperfeiçoada.

Neurons are specialized cells of the Nervous System, with their function being based on the formation of the three primary sub cellular compartments – soma, axons, and dendrites – and on the neuritic network they form to contact and pass information to each other. The quantitative analysis of the characteristics of these structures can be used to study the relation between neuronal morphology and function, and to monitor distortions occurring in individual cells or at the network level that may correlate with neurological diseases. In this thesis a survey of freely available digital tools dedicated to neuronal images processing and analysis was made with an interest in their applicability to analyse our routinely acquired neuronal fluorescent bioimages. The selected program´ (NeuronJ, NeurphologyJ and NeuriteQuant) preprocessing requirements were first evaluated, and the programs were subsequently applied to a set of images of rat cortical neuronal primary cultures in order to compare their effectiveness in bioimage processing. Data obtained with the various programs was compared to the manual analysis of the images using the ImageJ analysis tool. The result show that the program that seems to work better with our fluorescence images is NeuriteQuant, since it is automatic and gives overall results more similar to the manual analysis. This is particularly true for the evaluation of the Neurite Length per Cell. One of the drawbacks is that the quantification of neuritic ramification does not give satisfactory results and is better to be performed manually. We also performed a survey of digital image processing tools dedicated to phase contrast microphotographs, but very few programs were found. These images are easier to obtain and more affordable in economic terms, however they are harder to analyse due to their intrinsic characteristics. To surpass this gap we have established and optimized a sequence of steps to better extract relevant information of neuronal phase contrast images using ImageJ. The work-flow developed, in the form of an ImageJ macro named NeuroNet, was then used to answer a scientific question by applying it to phase contrast images of neuronal cultures at different differentiating days, in the presence or absence of a pharmacological inhibitor. The developed macro NeuroNet proved to be useful to analyse the images however there is still space to improvement.